土肥原調到沈陽後幾個月，就爆發了九一八事變。事變發生時，土肥原正奉召到東京彙報東北情況。戰後遠東國際軍事法庭仍然判定：“土肥原賢二確為1931年沈陽事變的共謀者之一”。主要理由是：1.事變發生時他雖然不在沈陽，但由他主持的土肥原特務機關是發動事變的中心。2.土肥原被召回東京時，在報刊公開主張：“關於滿洲一切懸案應從速解決，如有必要應以武力進行解決”。3.事變發生後3天，土肥原即從東京返回，就任沈陽市長。4.土肥原是將遜帝溥儀由天津轉移到東北的陰謀策劃與實施者。因此，遠東國際軍事法庭以土肥原對九一八事變有“共謀侵略計劃罪”而提出公訴，並認為罪證“均確鑿無疑”。
九一八事變後，土肥原提出在東北建立以遜帝溥儀為首的滿蒙“五族共和”體製的日本傀儡政權。在關東軍的支持下，他親自趕赴天津，製造“便衣隊”暴亂事件，乘機將溥儀從天津劫持到東北。在土肥原等人的導演下，以溥儀為首的偽滿洲國政權很快成立，東北淪為日本的殖民地。在長達14年之久的殖民統治下，日本從中國東北掠奪了大量資源，東北人民遭受了深重災難。
日本侵占東北後，又向華北擴張。與日本的侵略政策一致，土肥原於1933年再次充任沈陽特務機關長，開始策劃“華北自治運動”。當時，華北山海關、唐山、通州等地的特務機關，全部劃歸土肥原領導。在他的策劃下，特務機關先後對閻錫山、韓複榘、宋哲元等中國地方首腦進行拉攏，企圖使他們脫離國民政府，另立自治政權，但沒有收到成效。於是，土肥原又開始尋找其他機會。
1935年5月，4名日本軍人在察哈爾省由多倫經張北縣沿途偷繪地圖，到達張北時因無證件而被中國軍隊扣留。土肥原立即以此為由向冀察當局施加壓力，逼迫察哈爾省民政廳廳長秦德純與之簽訂《秦土協定》。該協定主要內容包括：
1. 向日軍道歉，撤換與該事件有關的中國軍官。
2. 停止國民黨在察哈爾的一切活動。
3. 成立察東非武裝區，第29軍從該地區全部撤退。
4. 取締察哈爾省的排日機關及排日活動。
5. 撤換宋哲元的察哈爾省主席職務。
1935年10月，土肥原特務機關進入北京後，繼續策劃以分裂中國為目標的“華北自治運動”。戰後遠東國際軍事法庭認證，土肥原曾親自與國民黨冀東行政督察專員殷汝耕進行密商，要求後者“起事”。在土肥原的煽動下，殷汝耕於11月25日在通縣宣告脫離國民政府，成立“冀東防共自治政府”，並發表了親日宣言。冀東偽政權成立後，土肥原又鼓動主持華北軍政的宋哲元與殷汝耕合作，成立“華北五省聯盟自治政府”。宋哲元得到國民政府同意後，成立了冀察政務委員會。土肥原擔任冀察政務委員會顧問，並安插了一些親日分子充當委員。
1936年3月，土肥原奉調回國出任留守第一師團師團長。1937年3月，他又被任命為第14師團師團長。1937年盧溝橋事變爆發，日本發動了全麵侵華戰爭，土肥原奉命率部入侵中國。8月20日，土肥原部在塘沽登陸，之後在華北作戰，一路殺向保定、石家莊、邢台、邯鄲、磁縣、大名、安陽、新鄉，直抵黃河渡口。因其進軍迅速，被日本報紙稱為是“華北戰場上的一顆明星”。
1938年5月，土肥原率部渡黃河進入隴海鐵路向鄭州方麵進攻。中國軍隊為阻止日軍沿平漢鐵路進攻武漢，在花園口掘開黃河堤岸，以黃河之水阻止日軍行進。土肥原部被洪水圍困月餘。黃河決堤造成中國人民數十萬人死亡和1200餘萬人流離失所，日軍的侵略是該事件的根本起因。
1938年6月，日本為在占領區組織統一的偽政權，成立了對華特別委員會，調土肥原中將負責，稱“土肥原機關”，後改稱“重光堂”，在上海設辦事處。該特務機關成立後，在土肥原的主持下，先後對唐紹儀、吳佩孚、靳雲鵬做工作，但並未取得成效。1938年底汪精衛叛國出走後，日本改將汪作為統一中國偽政權的對象。