周恩來為挽救革命危機而提出的對蔣策略可謂高瞻遠矚。可惜，武漢爭論的結果，卻是否定了這一真知灼見。鮑羅庭與陳獨秀作出了符合汪精衛希望同蔣介石妥協的心理的決定——繼續北伐。
由於放棄對主要敵人的討伐，使蔣介石得以站穩腳跟，鞏固反革命政權。蘇、浙、皖、閩、粵、桂等廣大地區均落入他的獨裁的魔掌。
5月下旬，周恩來乘搭英國怡和公司的輪船秘密離滬赴漢，繼續主持中央軍委。這時武漢國民政府雖然在表麵上還披著國民黨左派的外衣，但還是露出寧漢合流的端倪，周恩來到達武漢，就敏感地察覺到武漢政府將在叛變，國共兩黨必然分裂，武裝鬥爭不可避免。而陳獨秀在右傾錯誤道路上越滑越遠。他一廂情願地維護與國民黨的合作關係，換來的卻是一片反共殺聲。7月，汪精衛在武漢公開叛變；他咬牙切齒地說：“本人願為殺共之劊子手焉。”大江南北，血流成河。轟轟烈烈的大革命徹底失敗了。
風雲突變，煙雨莽蒼，中國革命的出路在哪裏？鮮血和挫折給人以痛苦也給人以覺醒，它常常出現曆史轉折的契機。1927年7月12日，共產國際調回鮑羅庭，中共中央進行改組，停止了陳獨秀的職務，眾望所歸的周恩來，被選為新的五人常委之一。7月13日新的黨中央召開緊急會議，決定以革命的武裝反對反革命武裝的新策略。
這時，南昌出現了有利於起義的軍事條件，駐南昌的朱培德部隊，大部分在吉安、進賢一帶，南昌城內兵力單薄。而根據周恩來的部署，受我黨掌握和影響的部隊，即賀龍領導的第二十軍和葉挺領導的第十一軍二十四師等，正從武漢開到九江，準備集中南昌。
中共中央接受周恩來提出的在南昌舉行武裝起義的建議並委派他擔任領導武裝起義的前敵委員會書記。
7月中旬，賀龍、葉挺的部隊從武漢開到九江鐵路沿線。汪精衛匆忙於7月24日跑上廬山，和孫科、朱培德、張發奎等密謀策劃，企圖誘騙賀龍、葉挺上廬山“開會”，以解除他們的兵權。在第二方麵軍第四軍擔任參謀長的葉劍英，察覺了這個陰謀，立即秘密會見了賀龍、葉挺。他們在煙水亭附近的甘棠湖麵的一條小船上，商討了對策，決定不上廬山、不理睬要部隊集結德安的命令，立即將部隊直開南昌。
7月下旬，周恩來仆仆風塵、不顧疲勞和危險，身穿樸素的中山裝，手提一個黑色皮包，在陳賡的護送下，從武漢出發，途經九江於26日秘密到達南昌，住進朱德在花園角二號的寓所。周恩來很快了解南昌敵我情況，日以繼夜運籌決策，7月27日，在南昌市中心的江西大旅社，周恩來主持了前敵委員會會議，決定成立起義總指揮部，賀龍為總指揮，葉挺為前敵總指揮，於7月30日晚舉行武裝起義。
在南昌起義臨近爆發的緊急時刻，中央常委張國燾從武漢趕到九江，以“中央代表”的身份，接連給前委發來兩封密電，說“暴動宜慎重”，要等他到南昌再決定是否起義。7月30日早晨，他趕到南昌，又提出種種“理由”反對起義。周恩來毅然決然地拒絕他的錯誤主張，指出：“我黨應該站在革命隊伍領導地位，獨立地領導武裝鬥爭。陳獨秀已經把我們害得好苦，再按他的主張搞下去，就要招致亡黨之禍。暴動斷不可推遲，更不可停止，否則將斷送革命。必須按計劃進行起義。”31日晨，張國燾又以修改起義宣言為借日，企圖繼續阻撓起義。麵對張國燾的無理糾纏，周恩來抽身斷絲，激動地對他說：“宣言我來改”。接著，當機立斷，簽署向國民黨反動派打響第一槍的作戰命令。
南昌起義的勝利，使國民黨反動派的各個集團大為震驚，南京和武漢隨即調兵遣將，向南昌反撲，欲置起義軍於死地而後快。汪精衛聽到南昌起義消息後，從廬山趕回武漢，“心摧發指”地大罵：“一個共產黨就和一條毒蛇，一隻猛獸一樣，決不能聽任他留種於人世的。”
因“二期北伐”敗績，引起多方不滿，而采取“以退為進”策略，“下野”回到奉化老家的蔣介石，在表麵上悠然於山水之間，實際上一刻也未離開中國的政治舞台。周恩來率南昌起義軍直指廣東，使他心急如焚。蔣介石對於和江西接壤三千餘裏，曆來軍政變動互相影響的戰略後方廣東，從來都不敢掉以輕心；尤其當他確知與自己尚存芥蒂的汪精衛對周恩來挺進廣東樂得“拱手相送”時，便立即相應采取措施，急令盤踞兩廣的國民革命軍第八軍總指揮李濟深加強粵湘邊界、粵贛邊界警戒，並主動進入贛境，阻截周恩來。李濟深把兩廣反動軍隊4萬人編為左中右三路，由範石生等為總指揮，全力阻擊。
南昌起義部隊在南一途中，打了一些勝仗。他們一心想打回廣東，再次舉行北伐，因而沒有與農民運動結合起來著手建立根據地。9月下旬，起義部隊在潮汕同優勢敵軍的戰鬥中失敗。
10月3日，前敵委員會在普寧流沙天後廟召開最後決策會議。南昌起義後的周恩來病魔纏身，高燒40度，由擔架抬來主持會議。他首先就戰事失利作了檢討並部署善後工作：武裝人員盡可能收集整頓，向海陸豐撤退，堅持長期鬥爭；非武裝人員按中央指示，分別向海口撤退，然後赴香港、上海。他最後以堅毅的目光巡視大家，說：“我的病不要緊，我不能離開部隊，準備到海陸豐去，扯起蘇維埃的旗幟！”
在敵人瘋狂追捕的艱難環境中，周恩來帶著重病之軀轉移到海陸豐南塘黃厝寨。周恩來興奮地說：“這就好了，革命軍隊和革命群眾相結合，南昌起義的革命火焰又要在海陸豐猛烈燃燒起來了。”然而周恩來的病情日益加重，有時因高燒加上發瘧疾而神誌不清，必須迅速轉移到香港就醫。10月底，周恩來在中共汕頭地委書記楊石魂以及葉挺、聶榮臻等的護送下，乘木船赴香港。
9月底，住在溪口的蔣介石脾氣很躁，對親信侍從往往濫發脾氣，妄加指責。有一次，蔣小品燒了一隻雞汁芋頭，蔣吃得津津有味，不覺多吃了一些。當他伸手要孟副官添飯時，似覺過飽，就問孟添過幾次？孟答已添過兩次，蔣介石即離席回臥室休息。一會兒因肚飽難受，他怒氣衝衝地將孟叫到臥室大罵：“你是個飯桶！我叫你添飯你就添，難道你沒有發覺我吃飽了嗎？”有時他心不高興，就戴著白手套去撫摸窗欄門檔角落，發現白手套有些汙漬，對著侍從者臭罵一頓，以泄胸中悶氣。
10月13日，蔣介石在東京拜會了軍國主義團體黑龍會的首領山頭滿，親筆書贈“親如一家”條幅。山頭滿在回憶這段往事時說：“蔣介石對於共產黨，不管在國內或者國外，一定要加以排斥的。”