按照穆宗的布置，高拱是外庭的顧命大臣中排名最前的；在宮中，小皇帝自然還得依靠馮保。但是，馮保與高拱的關係非常惡劣。此前，司禮監幾次掌印太監職位空缺，高拱先後推薦了陳洪、孟衝，就是不願讓馮保做掌印太監。馮保此人知書達理，又喜愛琴棋書畫，很有涵養，所以很受穆宗的喜愛。馮保利用皇權更迭之間的權力真空，輕鬆地通過一道遺詔，就驅走了孟衝，自己做了掌印太監。但是，就高拱來說，對馮保自然是必欲除之而後快。在高拱的授意下，工科都給事中程文、吏科都給事中雒遵、禮科都給事中陸樹德都開始彈劾馮保。由此，一場政治鬥爭勢必不免。鬥爭中，衝突雙方是馮保和高拱，而張居正表麵上是幫助高拱的。但是，實際上，張居正與馮保關係非常密切，早就預謀趕走高拱了。
隆慶六年六月十六日，馮保就利用高拱曾經說過的“十歲太子如何治天下”一語把自視甚高、性格粗直的高拱趕離京城。高拱一走，高儀也驚得嘔血三日而亡。三位內閣顧命大臣中隻剩下張居正一人，擔當輔弼小皇帝的重任。從此以後，萬曆朝的前10年，小皇帝的生活基本上是受三個人的規範：一個是自己的母親慈聖李太後，一個是司禮監掌印太監馮保，一個是內閣大學士張居正。
神宗需要侍奉兩位母親。一位是嫡母仁聖皇太後，即原來穆宗的皇後陳氏；一位是生母慈聖皇太後李氏。仁聖皇太後體弱多病，不能生育，卻很疼愛小皇帝。據說，小皇帝還是太子的時候，經常去皇後那裏玩。陳氏每次聽見太子跑的鞋聲，就非常高興。所以，神宗雖然尊崇自己的生母李氏，即改變過去皇帝生母隻稱“徽號加太後”的慣例，為李氏加“皇”字，稱“慈聖皇太後”，但是，對於嫡母仁聖皇太後始終非常尊敬，一視同仁，備極孝心。當時人稱神宗之孝順，乃“古今帝王之孝所稀有也”。比起他的祖父世宗以宮廷逼仄的理由勒令孝宗張皇後遷居於宮城幽僻之地來，神宗顯然是有情有義得多。不過，小皇帝的監護人主要還是生母慈聖皇太後。慈聖皇太後生性淳樸善良。例如，她雖然母以子貴，但是對於仁聖皇太後卻非常恭敬。萬曆九年（1581）她為女兒壽陽公主選駙馬的時候，麵對侯拱宸等三位候選人，唯獨選擇了衣冠樸素、戰戰兢兢的侯拱宸，還說：“此子渾樸不雕，真我家兒也。”對於兒子，慈聖太後也一心想讓他成為一個有為之君。據說，太後“教帝頗嚴”。每次萬曆小皇帝不讀書，李太後就命令皇帝跪在地上。
要上朝的一天，五更時分太後就到皇帝睡覺的地方，叫他起來，命太監們把小皇帝扶起來，為他洗臉，催他上駕。有一次，小皇帝在宮中喝多了一點酒，命內侍唱歌。內侍回答說不會唱。小皇帝大怒，說內侍竟敢抗旨，拿起劍就刺，在左右的勸解下，小皇帝玩耍般地割了兩個內侍的頭發，算是將他們“斬首”了。這件事傳到了慈聖皇太後的耳朵裏。太後非常生氣，命小皇帝在地上跪了很久，曆數他的過錯。小皇帝嚇得涕泗橫流，請求讓他改正錯誤。這事才算了結。還有一次，皇帝在太監孫海、客用的引導下喝了酒，受二人的引誘將馮保的兩名養子打傷，又騎馬直奔馮保的住所。馮保被嚇得隻能抱起巨石撐住大門。第二天，馮保將此事稟告太後。慈聖皇太後立即換上青布衣服，不帶首飾，命召閣、部大臣，要謁告太廟，將萬曆小皇帝廢了。小皇帝嚇壞了，趕緊前去請罪。太後說：“天下大器難道就是您可以繼承的麼？”意思是要改立神宗的弟弟潞王。神宗跪在地上哭了多時，皇太後才肯寬恕。