嘉靖四十二年（1563）八月十七日，朱翊鈞出生在裕王府，是朱載垕的第三子。朱翊鈞的誕生給裕王府帶來歡樂，王府張燈結彩，來道賀的人絡繹不絕，熱鬧非凡。然而，這種喜慶的氣氛很快就煙消雲散了，代之的是人人自危的恐怖現象。原來朱翊鈞的祖父嘉靖皇帝，對於這個皇孫的出世並不高興，而是產生一種憤恨的心理。因此，關於朱翊鈞的誕生，沒人敢報告皇帝，更不敢為之起名字。直到5歲時，這個皇孫才有了朱翊鈞這個名字。
嘉靖皇帝晚年更加多疑，他怕裕王朱載垕威脅他的皇位，連過年過節都不準裕王去看他，更不用說平常問安了，這種不正常的父子關係給裕王的精神上帶來很大不安，但是，朱載垕知道，中國傳統的父死子繼的法規是不能變的，也正是這一點支持著他，給他希望和安慰，讓他安靜地等待時機，因為嘉靖皇帝此時隻有他這一個繼承人了。如其所願，1566年，嘉靖皇帝病逝，臨終遺言的第一條就是讓裕王朱載垕繼位。同年，朱載垕即皇帝位，是為穆宗。朱翊鈞令他的父皇喜歡。隆慶二年（1568）朱翊鈞被立為太子，那時他剛剛6歲。有一天，父親在宮中馳馬，跑得很快，朱翊鈞對父親說：“陛下是天下之主，小心點，別摔著。”穆宗皇帝聽了，高興地跳下馬來，把他抱在懷裏，並給予賞賜。陳皇後有病另居別宮，朱翊鈞每天都隨母親李貴妃去探望，陳皇後聽到他的腳步就非常喜歡他，總是勉強爬起來出門迎接。皇後拿來經書考問他，朱翊鈞總是對答如流，李氏也很高興。由於他的關係，兩宮相處十分融洽和睦。
隆慶六年，隆慶皇帝龍馭上賓。9歲的皇太子穿著喪服接見了臣僚。按照傳統的“勸進”程式，全部官員以最懇切的辭藻請求皇太子即皇帝位。頭兩次的請求都被皇太子所拒絕因為父皇剛剛駕崩，自己的哀慟無法節製，哪裏有心情去想到個人名位？到第三次，他才以群臣所說的應當以社稷為重作為理由，勉如所請。這一番推辭和接受的過程，有條不紊，有如經過預習既然登上皇帝的寶座，他就必須對各種禮儀照章辦理。在同樣莊嚴的儀式下，萬曆皇帝授予他的兄弟叔侄輩中的一些人以“王”的稱號，封他們的妻子為“王妃”，批準他們子女的婚姻。而最隆重的儀式，卻是把“仁聖皇太後”的尊號上贈給他的嫡母隆慶的皇後陳氏，把“慈聖皇太後”的尊號上贈給他的生母隆慶的皇貴妃李氏。
慈聖皇太後對萬曆皇帝有極大的影響，因為除了她，沒有第二個人再能給他以真正的天性之愛。但是在萬曆登基以後，根據皇家的習俗，一種無形的距離就存在於太後和皇帝之間，使母子之間的天性交流變得極為不便。例如前此不久萬曆曾下令修尊裝滿慈聖所居住的宮室，竣工之後，她的感謝不是用親切的口吻加以表達，而是請學士寫成一篇文章，讚賞皇帝的純孝，在他下跪時逐句誦讀。這篇文章，因為能對全國臣民起表率和感化的作用，所以就成為本朝的重要文獻。有時，萬曆用宮內的傀儡戲來討取太後的歡心，在她下轎之前，他也必須跪在庭前恭候想駕。但是母愛畢竟是一種最深刻的感情，在多年之後，盡管萬曆皇帝臨朝的機會越來越稀少，每當十一月慈聖的生辰，他卻仍然親臨皇極門接受百官的慶賀。
也就是在此之前不久，萬曆冊封他的愛妃鄭氏為皇貴妃，並預先公市禮儀以便各有關衙門作必要的準備。消息傳來，就有一位給事中上疏提出異議，其理由為：按照倫理和習慣，這種尊榮應該首先授予皇長子的母親恭妃王氏，德妃鄭氏僅為皇三子的母親，後來居上，實在是本末顛倒。這一異議雖然引起萬曆的一時不快，但冊封典禮仍按原計劃進行。但誰也沒有想到，這一小小的插曲，竟是一場影響深遠的政治鬥爭的契機，導致了今後數十年皇帝與臣僚的對立，而且涉及到了整個帝國。
隆慶六年（1572）五月二十二日，宮中傳出穆宗病危的消息。三天之後，即二十五日，內閣大學士高拱、張居正、高儀被召入宮中。高拱等人進入寢宮東偏室，見穆宗坐在禦榻上，榻邊簾後坐著皇後、皇貴妃，10歲的太子朱翊鈞就立在禦榻的右邊。穆宗抓住高拱的手，臨危托孤：“以天下累先生”，“事與馮保商榷而行。”接著，司禮監太監馮保宣讀給太子朱翊鈞的遺詔：“遺詔與皇太子。朕不豫，皇帝你做。一應禮儀自有該部題請而行。你要依三輔臣並司禮監輔導，進學修德，用賢使能，無事荒怠，保守帝業。”三輔臣即高拱、張居正、高儀三人。司禮監的地位也很重要，司禮監秉筆太監兼提督東廠馮保其實也在顧命之列。三位大學士受托之後，長號而出。第二天，隆慶皇帝即崩於乾清宮。六月初十，皇太子朱翊鈞正式即位，改元萬曆。是為明神宗。