產品質量:鐵含量為2.0%,血紅素純度為23%,大腸杆菌<30MPN/100g,無致病菌。
2. 血紅素的測定方法
標準曲線的繪製:準確稱取血紅素(藥檢用品)標準品22mL,置於100mL棕色容量瓶中,用2.8%氨水溶解並稀釋到100mL加入檢樣量,0號管為空白,於390nm處測定光吸收值。
以各管吸收值為縱坐標,血紅素濃度為橫坐標做曲線圖。
3.樣品測定
準確稱取2.0~3.0mg血紅素樣品,用氨水(濃氨水稀釋10倍)稀釋至100mL,按上法測定,並從標準曲線中查得樣品含量,根據取樣量即可求得樣品中血紅素含量。
二、凝血酶的製備
凝血酶是機體凝血係統中的天然成分,它由兩條肽鏈組成,多肽鏈之間以二硫鍵相連接。凝血酶在體內以凝血酶原形式存在,在一定條件下凝血酶被激活並轉化為有活性的一種蛋白質水解酶。凝血酶相對分子質量為335800,呈白色無定形粉末,溶於水,不溶於有機溶劑,在2~8℃條件下很穩定,而在室溫下8h內失活,不耐熱、稀酸、堿等。
目前國內主要從動物血漿中及人血漿中製備凝血酶原,再經激活物激活而成為凝血酶。它可催化血纖維蛋白原血纖維肽A和B的斷裂,轉變成不溶性血纖維蛋白凝塊。凝血酶在臨床上應用廣泛,常以幹粉或溶液局部塗於傷口及手術處,控製毛細血管血液滲出,多用於骨出血、扁桃腺摘除和拔牙時出血等。有時也可口服,用於胃和十二指腸出血。凝血酶局部止血效果好,且無副作用。目前凝血酶的應用範圍正日浙擴大,由單純的局部外敷發展到外科手術、耳鼻喉、口腔、婦產、泌尿及消化道等部位出血的止血,也可作為多種外用止血藥物的重要原料,其止血效果優於“對氨基苯甲酸”、“止血環酸”、“止血敏”等通過注射後需經血管收縮而起止血作用的藥物,故深受廣大用戶歡迎。由於該藥臨床使用日漸廣泛,將使目前十分緊俏的凝血酶更趨緊缺,因此生產前景看好。
(一)凝血酶的提取工藝
1.工藝流程
2.工藝要點
(1)分離血漿取動物血液,按每100kg動物血液加3.8kg檸檬酸三鈉投料,攪拌均勻,裝入離心管中,以3000r/min的速度離心15min,分出血球(可供製備血紅素),收集血漿。
(2)提取凝血酶原把血漿溶於10倍的蒸餾水中,用1%濃度的醋酸調節pH至5.3,在離心機上離心15min,棄去上清液,收集的沉澱物即為凝血酶原。
(3)凝血酶原的激活在30℃條件下,將凝血酶原溶於1~2倍的9g/L NaCl溶液中,攪拌均勻,加入占凝血酶原重量1.5%的CaCl2,攪拌15min,在4℃下放置1.5h左右,保證凝血酶原轉化為凝血酶。
(4)沉澱分離凝血酶將激活的凝血酶溶液用離心機離心15min,棄去沉澱。上清液移入搪瓷桶中,加入等量的預冷至4℃的丙酮,攪拌均勻,冷處靜置過夜,然後用離心機分離,收集沉澱,上清液可供回收丙酮。沉澱用丙酮洗滌並研細,在冷處靜置3d左右,然後過濾,沉澱分別用乙醇和乙醚洗滌一次,放在幹燥器或石灰缸中幹燥,即得凝血酶粗品。
(5)除雜、沉澱、幹燥把粗品溶於適量(1倍左右)的9g/L NaCl溶液中,在0℃放置6h以上,然後用濾紙過濾,濾出的沉澱再用9g/L NaCl溶液溶解,在0℃放置6h以上,過濾,合並兩次濾液,用1%醋酸溶液調節pH至5.5,然後離心,棄去沉澱,收集上層清液。在清液中加入2倍量預冷至4℃的丙酮,靜置3h,離心30min,收集沉澱。沉澱再浸泡於冷丙酮中,靜置過夜,然後過濾,沉澱分別用無水乙醇、乙醚各洗滌一次,幹燥即得凝血酶產品。
(二)凝血酶質量標準與檢驗方法
1.質量標準
凝血酶質量標準應符合現行《中國藥典》(2005)中第二部“經激活而得的供口服或局部止血用凝血酶的無菌凍幹品,每1mg效價不得少於10單位。含凝血酶應為標示量的80%以上”的要求。
2.凝血酶效價測定
一般采用標準纖維蛋白測定法。凝血酶的單位定義為活度量,即1mL標準纖維蛋白原溶液在28℃,15s內產生凝集的量為一個單位。
具體操作:取凝血酶標準品,用9g/L氯化鈉溶液分別製成每1mL中含5.0單位、6.4單位、8.0單位、10.0單位的標準品溶液。另取內徑1cm、長10cm的試管4支,分別精密加入纖維蛋白原溶液0.9mL,置37℃±0.5℃水浴中保溫5min,再分別精密量取上述4種濃度的標準品溶液各0.1mL,迅速加入上述各試管中,搖勻、立即計時,置37℃±0.5℃水浴中,觀察纖維蛋白的初凝時間,每種濃度測5次,求平均值。標準品溶液的濃度應控製凝結時間在14~60s為宜。在雙對數坐標紙上,以標準品效價為橫坐標,凝結時間為縱坐標,計算回歸方程。
三、超氧化物歧化酶的提取
超氧化物歧化酶,簡稱SOD(Superoxid dismutase),是一種廣泛存在於動植物及微生物中的金屬酶。
(一)SOD的種類與作用
1.SOD的種類
(1)Cu·Zn-SODCu·Zn-SOD呈藍綠色,主要存在於真核細胞的細胞漿內,相對分子質量在32000左右,由兩個亞基組成,每個亞基含1個銅和1個鋅。
(2)Mn-SODMn-SOD呈粉紅色,其相對分子質量隨來源不同而異。來自原核細胞的相對分子質量約為4000,由兩個亞基組成,每個亞基各含1個錳;來自真核細胞線粒體的Mn-SOD,由4個亞基組成,相對分子質量約為80000。
(3)Fe-SODFe-SOD呈黃色,隻存在於真核細胞中,相對分子質量在38000左右,由兩個亞基組成,每個亞基各含1個鐵。
(4)Co·Zn-SODCo·Zn-SOD在牛肝中存在。
不同類型的SOD其化學性質有所不同,如牛紅細胞Cu·Zn-SOD對熱的穩定性較高,可耐受83℃,而豬血Cu·Zn-SOD對熱敏感,pH 7.6~9.0時穩定,pH為6.0以下和12.0以上不穩定,特別是pH為2.0以下極不穩定。SOD金屬酶在酶分子中,Cu和Zn的作用是不同的,Zn僅與酶分子的結構有關,與催化活性無關,而Cu卻與催化活性有關。Mn和Fe與Cu一樣,對酶的活性是必需的輔基。
SOD自1973年發現以來,至今已成功地研究出從動物肝髒和血液中分離和分析的方法。
2.SOD的作用
(1)在醫療業中的作用SOD是優良的超氧陰離子自由基清除劑,人體內的自由基過多或去除過慢會加速機體的衰老並誘發各種疾病。SOD能清除體內過多的自由基,目前發現SOD可能與機體衰老、腫瘤發生、自身免疫性疾病和輻射防護等有關,臨床上主要用於延緩人體衰老、防止色素沉著、消除局部炎症。特別是治療風濕性關節炎、慢性多發性關節炎及放射治療後的炎症,無抗原性,毒副作用較小,是很有臨床價值的治療酶。
(2)在日用化工業中的作用含有SOD的化妝護膚品備受女士的青睞,其產品具有很強的競爭力。如市場上銷售的許多高級護膚化妝品,都因添加了SOD而俏銷。SOD將成為廣大藥廠和日用化工廠的重要原料,市場需求量大,充分利用動物廢棄液生產SOD是大有發展前途的。
(二)從牛血中提取SOD
1.工藝流程
2.工藝要點
(1)分離血球取新鮮牛血,按100kg牛血加3.8g檸檬酸三鈉投料,攪拌均勻,裝入離心管中,在離心機中以3000r/min的速度離心15min,收集血球,血漿可用於製備凝血酶。