胸腺製劑是一種由動物胸腺分離到的具有促淋巴細胞增生的免疫活性蛋白質,到20世紀90年代後期臨床上使用的胸腺製劑比較多,大約有30餘種,大部分是小牛、小羊或豬的胸腺和血液中的提取物,分子質量從1000~15000u,命名也比較混亂,胸腺素、胸腺激素、胸腺肽、胸腺因子等。目前在臨床上使用的主要是胸腺肽片段(分子質量小於10ku)和已知化學結構的多肽,我們所熟知的胸腺素α1就屬於後者。
一、胸腺素的提取
1966年Goldstein首先從小牛的胸腺組織中提取到一種生物大分子,命名為胸腺素(Thymosin),並應用到臨床。我國隨後也從豬的胸腺中提取製備出相同的物質。胸腺素主要用於自身免疫疾病。
(一)化學組成和性質
對胸腺素的深入研究發現,它是多種肽類組成的一類物質。分子質量的分布在1000~15000u。等電點pI的分布在3.5~9.5。pI小於5.0的多肽為α型;介於5~7之間的為β型;大於7.0的為γ型。一般表現生物活性的胸腺素主要為α和β型,又分做α1、α5、α7、β3和β4等組分。其中的α1型是主要的活性成分,其一級結構。
研究發現,胸腺素α1的一級結構中具有兩個相同氨基酸分子重複的片斷,共有6處,這種現象非常罕見。胸腺素具有調節胸腺依賴性淋巴細胞分化和體外免疫反應的活性。
(二)製備工藝
1.工藝流程
2.工藝要點
(1)提取、除雜蛋白將采集的新鮮或冷凍的豬胸腺用絞肉機絞碎,加入2倍量的9g/L NaCl溶液,用1∶1的HCl調節pH至3.0,然後在10℃以下攪拌提取4~5h。過濾,濾渣加1倍量9g/L NaCl溶液再提取1h左右。合並2次提取液,用0.3g/mL的NaOH溶液調節pH至7.0左右,在80℃的條件下保溫15min,然後冷卻至10℃以下,離心除去雜蛋白,收集澄清液。
(2)沉澱澄清液在攪拌下加入5倍量預冷至10℃以下的冷丙酮,然後靜置4h,過濾收集沉澱。用丙酮、乙醚脫水,得淡黃色丙酮粉。
(3)分段鹽析將丙酮粉溶於6倍體積pH為7.0的0.01mol/L CPB(溴代十六烷基吡啶)溶液中,攪拌30min,過濾或離心,收集清液。沉澱可再處理一次,合並清液。清液中加硫酸銨到25%飽和度,調節pH至7.0,靜置3~4h,過濾收集清液,沉澱棄去。清液用HCl調節pH至4.6,攪拌下補加硫酸銨至50%飽和度,在4℃下靜置2~3h。收集鹽析沉澱。
(4)透析鹽析沉澱溶於5倍量的蒸餾水中,調節pH至7.0,然後裝入透析袋中對冷蒸餾水透析至無硫酸根離子(用氯化鋇檢查無白色沉澱為止),再對pH為7.0、0.01mol/L CPB溶液透析10h。透析液離心除沉澱。
(5)柱層析將上述離心液經DEAE-纖維柱吸附,然後用pH為4.0的0.002mol/L CPB溶液洗脫。收集洗脫液,加入4倍量冷丙酮,攪勻後,靜置3~4h,過濾收集沉澱。