一、實驗目的
（1）進一步學習並掌握光學顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用方法。（2）觀察並掌握酵母菌的細胞形態。（3）學習並掌握鑒別酵母菌細胞死活的方法和原理。（4）學習並掌握血球計數板計數的原理。（5）掌握利用血球計數板進行微生物計數的方法。
二、實驗原理酵母菌：酵母菌細胞一般呈卵圓形、圓形、圓柱形或檸檬形。酵母細胞核與細胞質有明顯的分化，個體直徑比細菌大幾倍到十幾倍。繁殖方式也較複雜，無性繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌絲。有性繁殖是通過接合形成子囊及子囊孢子。
（一）美藍鑒別酵母菌死活細胞原理美藍是一種弱氧化劑，氧化態呈藍色，還原態呈無色。用美藍對酵母細胞進行染色時，活細胞由於細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能將美藍由藍色的氧化態轉變為無色的還原態，從而細胞呈無色；而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則由於細胞內還原力較弱而不具備這種能力，從而細胞呈藍色，據此可對酵母菌的細胞死活進行鑒別。
（二）血球計數板計數原理利用血球計數板在顯微鏡下直接計數，是一種常用的微生物計數方法。該方法是將菌懸液放在血球計數板與蓋玻片之間容積一定的計數室中，在顯微鏡下進行計數，然後根據計數結果計算單位體積內的微生物總數目。血球計數板是一塊特製的載玻片，其上由4條槽構成3個平台。中間較寬的平台又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平台上各刻有一個方格網，每個方格網共分為9個大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的邊長為1mm，中間平台下陷01mm，故蓋上蓋玻片後計數室的容積為01mm3。血球計數板的構造如圖6\|1。圖6\|1血球計數板的構造
計數時，通常數5個中方格的總菌數，再換算成1mL菌液中的總菌數。
三、實驗器材
（1）材料：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）24～28h液體培養物。（2）試劑：01%呂氏堿性美蘭染色液、005%呂氏堿性美蘭染液、乙醇\|乙醚（3∶7，V/V）混合液。（3）儀器：顯微鏡、擦鏡紙、載玻片、血球計數板、蓋玻片、接種環、酒精燈、鑷子、計數器、電吹風等。
四、實驗步驟
（一）美藍染色觀察酵母細胞形態和死活細胞的鑒別（1）染色：在幹淨的載玻片中央加一小滴01%美藍染色液，然後再加一小滴預先稀釋至適宜濃度的釀酒酵母液體培養物，混勻後從側麵蓋上蓋玻片，並吸去多餘的水分和染色液（注意染色液和菌液不宜過多或過少，應基本等量，且要混勻）。（2）鏡檢：將製好的染色片置於顯微鏡的載物台上，放置約3min後進行鏡檢，先用低倍鏡，後用高倍鏡進行觀察，根據細胞顏色區分死細胞（藍色）和活細胞（無色），並進行記錄。（3）比較：染色約30min後再次進行觀察，注意死細胞數量是否增加。（4）用005%呂氏堿性美蘭染液重複上述操作。（二）酵母細胞計數（1）菌懸液的製備：以無菌生理鹽水將釀酒酵母培養物製成濃度適當的菌懸液。（2）加樣品：將清潔幹燥的血球計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細作用自動進入計數室（注意取樣前要搖勻菌液，加樣時計數室不可有氣泡產生）。（3）找計數室：加樣後靜止5min，然後將血球計數板置於顯微鏡載物台上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數（注意調節顯微鏡光線強弱，使菌體和計數室線條清晰）。（4）顯微鏡計數：取左上、右上、左下、右下和中央5個中方格進行計數。位於中方格邊線上的菌體一般隻計上邊和右邊線上的（或隻計左邊和下邊線上的）。如遇到酵母出芽，芽體大小達到母細胞一半以上時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從上下兩個計數室中得到的平均數值來計算樣品的含菌量。計數公式：①1mL酵母菌液中的總菌數=5AB×104（個）