一、實驗目的
（1）了解細菌的生長特點及其生長的測定原理。（2）學習用比濁法測定細菌生長曲線的操作方法。
二、實驗原理
將少量細菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養基中，在適宜的條件下進行培養，定時測定培養液中的菌量，以菌數的對數作縱坐標，生長時間作橫坐標，作出的曲線叫生長曲線。依據其生長速率的不同，一般可把細菌生長曲線分為延滯期、對數期、穩定期和衰亡期。不同的微生物具有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養條件下，其生長曲線也不一樣。它反映了單細胞微生物在一定環境條件下於液體培養時所表現出的群體生長規律。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解該菌的生長規律，對於科研和生產都具有重要的指導意義。
圖9\|1單細胞微生物的典型生長曲線引自周德慶：《微生物學教程》第3版，高等教育出版社。測定微生物生長的方法很多，有血球計數法、平板菌落計數法、幹重法、比濁法等。本實驗采用比濁法測定，由於細菌懸液的濃度與其光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液中微生物的濃度。將所測得的OD值與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。
三、實驗器材
（一）菌種大腸杆菌（Escherichiacoli）。（二）培養基牛肉膏蛋白腖培養基。（三）儀器和器具721型分光光度計、比色杯、恒溫搖床、無菌吸管、試管、三角瓶。
四、實驗步驟（一）種子液製備取大腸杆菌斜麵菌種1支，以無菌操作挑取2環菌苔，接入盛有50mL牛肉膏蛋白腖培養基的三角瓶中，於37℃搖床振蕩培養10～12h作種子培養液。（二）標記編號取盛有50mL無菌牛肉膏蛋白腖培養液的250mL三角瓶11個，分別編號為0、15、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。（三）接種培養用2mL無菌吸管分別準確吸取2mL種子液加入已編號的11個三角瓶中，於37℃下振蕩培養（振蕩頻率250r/min）。然後分別按對應時間將三角瓶取出，立即放冰箱中貯存，待培養結束時同時測定OD值。（四）生長量測定以未接種的牛肉膏蛋白腖培養基作為空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從最早取出的培養液開始依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏蛋白腖液體培養基適當稀釋後測定，使其OD值在010～065以內，經稀釋後測得的OD值乘以稀釋倍數，即是培養液的實際OD值。注意：測定OD值前，將待測定的培養液進行振蕩，使細胞分布均勻。如條件具備，本實驗也可采用如下方法：（1）用1mL無菌吸管吸取025mL大腸杆菌種子液轉入盛有5mL培養液的試管中或是吸取2mL種子液到盛有50mL培養液的帶側臂試管的三角瓶中，混勻後將試管或三角瓶的側臂直接插入分光光度計（特製）的比色槽中，比色槽上方用自製的暗盒將試管或三角瓶及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環境，另以1支盛有培養液但沒有接種的試管作為空白對照，測定樣品培養0h的OD值。測定完成後，取出試管或三角瓶置37℃下繼續振蕩培養。（2）分別在培養15，3，4，6，8，10，12，14，16，20h，取出培養物試管或三角瓶按上述方法測定OD值。該方法準確度高，操作簡便，有條件的實驗室可以采用。
五、實驗記錄（1）將測定的OD值填入下表：時間/h01530406080100120140160200光密度值（OD600）（2）以上述表格中的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪製大腸杆菌的生長曲線。
六、思考題（1）為什麼說用比濁法測定的細菌生長隻是表示細菌的相對生長狀況？（2）在細菌生長曲線中為什麼會出現穩定期和衰亡期？在生產實踐中怎樣縮短延滯期？怎樣延長對數期及穩定期？
參考文獻
［1］朱旭芬.現代微生物學實驗技術［M］.杭州：浙江大學出版社，2011.
［2］沈萍，範秀容，李廣武.微生物學實驗［M］.3版.北京：高等教育出版社，1999.
［3］周德慶.微生物學實驗教程［M］.2版.北京：高等教育出版社，2006.