一、實驗目的
（1）學習和掌握堿裂解法小量製備質粒DNA的原理、方法和技術。（2）學習大腸杆菌感受態細胞的製備、轉化及轉化子鑒定的基本原理與操作技術。
二、實驗原理
（一）質粒DNA的小量製備質粒DNA是核外的環狀雙鏈DNA。在強堿作用下，核DNA與質粒DNA都會變形生成單鏈，在中性pH條件下質粒DNA發生變性，而核DNA保持單鏈狀態，再通過一係列分離純化即可得到純化的DNA。（二）大腸杆菌感受態細胞的製備和轉化感受態指細菌生長過程中能接受外源DNA而不將其降解的生理狀態。轉化實驗中，受體微生物需事先經處理製備為感受態細胞備用。轉化是將外源的DNA分子引入細胞，使其獲得新遺傳性狀的一種手段。常見的轉化方法有熱激法和電穿孔法等。熱激法是將細菌置於0℃的CaCl2低滲溶液中使細胞膨脹成球形，轉化混合物中的外源DNA經42℃短時熱激處理，進入受體，通過複製表達使受體細胞出現新的遺傳性狀。經篩選培養基中培養，即可獲得轉化子。（三）轉化子的鑒定為了便於轉化子的篩選鑒定，轉化實驗中采用的質粒DNA一般包含有特殊的遺傳特征，如抗生素抗性基因、顯色物質表達基因等，配合特定培養基可快速篩選出含有外源DNA的轉化子。三、實驗材料及儀器（一）材料E.coliDH5α菌株，帶有抗生素抗性基因且適用於E.coliDH5α的質粒如pUC18（帶有氨苄青黴素抗性基因）等。（二）設備恒溫搖床、電熱恒溫培養箱、台式高速離心機、無菌工作台、低溫冰箱、恒溫水浴鍋、製冰機、分光光度計、微量移液槍、15mLEP管。（三）試劑（1）LB固體和液體培養基。（2）氨苄青黴素母液（100mg/mL）。取Amp05g溶於5mL無菌水中，022μm濾膜過濾除菌，分裝後－20℃貯存。（3）含氨苄青黴素的LB固體培養基。將配好的LB固體培養基高壓滅菌後冷卻至60℃左右，加入Amp儲存液，使終濃度為50μg/mL，搖勻後鋪板。（4）005mol/LCaCl2溶液。稱取028gCaCl2（無水，分析純），溶於50mL重蒸水中，定容至100mL，高壓滅菌。（5）含15%甘油的005mol/LCaCl2。稱取028gCaCl2（無水，分析純），溶於50mL重蒸水中，加入15mL甘油，定容至100mL，高壓滅菌。
四、實驗步驟
（一）質粒DNA的小量製備（1）分別配製培養基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ備用，其成分如下：培養基：胰蛋白腖10g、酵母浸出物5g、NaCl10g。溶液Ⅰ：葡萄糖50mmol/L、Tris\|HCl（pH80）10mmol/L、EDTA1mmol/L。溶液Ⅱ（新鮮配製）：NaOH02mol/L、SDS1%。溶液Ⅲ：KAc294g、冰醋酸115mL、雙蒸水285mL。將配製好的溶液與包裝好的槍頭盒一起放入高壓滅菌鍋中滅菌。（2）接種菌培養。（3）取15mL培養物於EP管中，1300rpm離心1min集菌，去上清；再加入100μL預冷的溶液Ⅰ，振蕩器劇烈振蕩，使菌體懸浮，此時可看到EP管變渾濁。（4）加入200μL現配製的溶液Ⅱ，蓋緊管口，可看到EP管變澄清，迅速柔和顛倒數次以保證混合液與整個管內壁充分接觸，冰浴3～5min。（5）加入150μL的溶液Ⅲ，溫和顛倒數次以混合均勻，此時可看到EP管中有漿狀沉澱，冰浴10min。（6）13000rpm離心10min，取400μL上清於另一EP管。（7）用1mL70%乙酸洗一次，1300rpm離心5min，棄上清，將離心管倒置，溫室幹燥5～10min。（8）用20～30μLTE溶解，－20℃保存。（二）受體菌的培養及感受態細胞的製備從LB平板上挑取新鮮E.coliDH5α單菌落，於LB液體培養基中37℃培養過夜直到對數生長期，以1∶100比例稀釋接到LB液體培養基中，37℃250r/min培養3h（約含有109細胞/mL，OD600=035～04）。取35mL菌液於4mL離心管中冰上放置30min，使其停止生長。5000rpm離心5min，去上清。用冰冷的3mL50mmol/LCaCl2洗滌菌體。5000rpm離心5min，再用2mL50mmol/LCaCl2輕輕懸浮菌體，冰上放置15～30min，4℃5000rpm離心5min，棄去上清，用預冷的1mLCaCl2重懸製得大腸杆菌感受態細胞。注意：新製成的感受態細胞懸液於4℃下放置24h內，可以有效提高轉化效率。如果希望長期保存感受態細胞，可將細胞沉澱用甘油CaCl2懸浮，再將感受態細胞分成100μL的小份，存儲於－70℃保存。（三）轉化（1）在100μL的感受態細胞中加入10μL質粒，溫和混勻，冰上放置30min後，立即放入42℃水浴熱擊90s，再迅速轉移到冰浴中放置2～10min。（2）加入400μL新鮮LB培養基，37℃250r/min培養1h，使菌體複蘇並激活抗性標記基因。（3）5000rpm離心5min，用槍吸去上清，再用適量培養基重懸。取100μL塗布於含有篩選標記的LB平板上（平板培養基中已添加100μg/mLAmp），同時吸100μL未轉化的大腸杆菌感受態細胞塗布於以上平板中，作為陰性對照。（4）平板37℃正放1h充分吸收菌液後，倒置培養12～24h出現菌落。