一、實驗目的
學習用梯度平板法分離抗藥性突變株的原理和方法。
二、實驗原理
基因中堿基順序的改變可導致微生物細胞的遺傳變異，這種變異有時能使細胞在有害的環境中存活下來，抗藥性突變就是一個例子。微生物的抗藥性突變是DNA分子的某一特定位置的結構改變所致，與藥物的存在無關，某種藥物的存在隻是分離某種抗藥性菌株的一種手段，而不是作為引發突變的誘導物。在含有一定抑製生長藥物濃度的平板上塗布大量的細胞群體，極個別抗性突變的細胞會在平板上長成菌落。將這些菌落提取純化，進一步進行抗性試驗，就可以得到所需要的抗藥性菌株。抗藥性常用作遺傳標記，因而掌握抗藥性突變株的分離篩選方法是十分必要的。在自然條件下，想要獲得有抗性的細菌是很困難的。當給予適當的物理化學條件時，其突變率會大大增加，如α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外線、微波等。DNA對紫外線（UV）有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感，而且紫外線誘變要求實驗條件低、試驗操作簡單，因此，常被用作誘變劑，用於微生物菌種選育。經誘變處理後的微生物群體中，雖然突變數目大大增加，但所占的比例仍然是整個群體中的極少數。為了快速、準確地得到所需的突變體，必須設計一個合理的篩選方法，以殺死大量的未發生突變的野生型，而保留極少數的突變型。梯度平板法是篩選抗藥性突變型的一種簡便有效的方法，其操作要點是：先加入不含藥物的培養基，立即把培養皿斜放，待培養基凝固後形成一個斜麵，再將培養皿平放，倒入含一定濃度藥物的培養基，使其凝固，這樣就形成了一個藥物濃度梯度由濃到稀的梯度培養基。將誘變處理後的菌液塗布於培養基表麵，經培養後，在藥物濃度比較高的位置出現的菌落就是抗藥性突變株。
三、實驗器材
（一）菌種大腸杆菌（Escherichilacoli）。（二）培養基牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，2×（2倍濃度，營養成分濃度為普通培養基的2倍）牛肉膏蛋白腖培養液（分裝於離心管中，每管裝5mL），含100μg/mL鏈黴素的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基。（三）器皿培養皿（直徑6cm、9cm）、玻璃塗棒、移液管、滴管、台式低速離心機、磁力攪拌器等。（四）試劑及溶液生理鹽水、鏈黴素溶液。
四、實驗步驟
（一）製備菌液從已活化的斜麵菌種上挑1環大腸杆菌於裝有5mL牛肉膏蛋白腖培養液的無菌離心管中（接2支離心管），置37℃條件下培養16h左右，離心（3500rpm，10min），棄上清液後再用生理鹽水洗滌2次，棄上清液，重新懸浮於5mL的生理鹽水中。將2支離心管的菌液一並倒入裝有玻璃珠的三角瓶中，充分振動以分散細胞，製成濃度為108/mL的菌液。然後吸3mL菌液於裝有磁力攪拌棒的培養皿（直徑6cm）中。（二）紫外線照射（1）預熱紫外燈：紫外燈功率為15W，照射距離30cm（可在超淨工作台中進行）。照射前先開燈預熱30min。（2）照射：將培養皿放在磁力攪拌器上，先照射1min後再打開皿蓋並開始計時，照射2min後，立即蓋上皿蓋，關閉紫外燈。（三）增殖培養（在暗室紅燈或黃燈下操作）照射完畢，用無菌滴管將全部菌液吸到含有3mL2×牛肉膏蛋白腖培養液的離心管中，混勻後用黑紙包裹嚴密，置37℃培養過夜。（四）梯度培養皿的製備取10mL牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基於直徑9cm的培養皿中，立即將培養皿斜放，使高處的培養基正好位於皿邊與皿底的交接處。待凝固後，將培養皿平放，再加入含有鏈黴素（100μg/mL）的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基10mL。凝固後，便得到鏈黴素從0到100μg/mL逐漸升高的濃度梯度培養皿。然後在皿底藥物濃度從低到高的方向做一個“→”符號標記。圖12\|1梯度平板示意圖