一、實驗目的掌握酵母菌有性雜交育種的基本原理和方法。二、實驗原理雜交是在細胞水平上進行的一種遺傳重組方式。有性雜交，一般指不同遺傳型的兩性細胞間發生的接合和隨之進行的染色體重組，進而產生新遺傳型後代的一種育種技術。凡能產生有性孢子的酵母菌、黴菌和蕈菌，原則上都可采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進行育種。釀酒酵母有其完整的生活史（圖11\|1）。從自然界分離到的，或在工業生產中應用的菌株，一般都是雙倍體細胞，而發生有性結合的酵母必須是單倍體，而且要求接合型不同。因此，無論哪種類型的酵母在進行有性雜交時，首先必須經過單倍體化，即將酵母培養在生孢子培養基中，使其產生子囊，經過減數分裂後，在每一個子囊內會形成4個子囊孢子（單倍體），其中2個為a型，2個為α型。獲得單倍體後，需對其接合型進行驗證，一般使用標準接合型的單倍體酵母和待測菌株進行有性雜交，能和標準的a型酵母進行接合的為α型，反之則為a型。為了便於檢測雜交子，一般要求用於實驗的單倍體具有遺傳標記。用蒸餾水洗下子囊，用機械法（加矽藻土和石蠟油後在勻漿管中研磨）或酶法（用蝸牛消化酶等處理）破壞子囊，再進行離心，然後把獲得的子囊孢子塗布平板，就可以得到由單倍體細胞組成的菌落。把來自不同親本、不同性別的單倍體細胞通過離心等方式使之密集地接觸，就有更多機會出現種種雙倍體的有性雜交後代。它們與單倍體細胞有明顯的差別（見表11\|1），易於識別。在這些雙倍體雜交子代中，通過篩選，就可得到優良性狀的雜種。圖11\|1釀酒酵母的生活史
表11\|1釀酒酵母的雙倍體和單倍體細胞的比較比較項目雙倍體單倍體細胞大、橢圓形小、球形菌落大、形態均一小、形態變化較大液體培養繁殖較快、細胞較分散繁殖較慢、細胞常聚集成團在產孢子培養基上會形成子囊不形成子囊有性雜交的步驟一般包括：二倍體親本的選擇、單倍體化、接合型驗證、遺傳標記製作、有性雜交、雜種的獲得和性能的測定。本實驗從兩個已知接合型和遺傳標記的單倍體酵母為出發菌，通過有性雜交獲得雜交子。三、實驗器材（一）菌種釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）單倍體腺嘌呤缺陷型（ade-）菌株Z1，接合型為a；釀酒酵母單倍體組氨酸缺陷型（his-）菌株Z2，接合型為α。（二）培養基（1）完全培養基：蛋白腖2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH60，117℃滅菌10min。（2）基本培養基：葡萄糖2%，NaCl01%，K2HPO401%，MgSO4·7H2O005%，（NH4）2SO405%，處理瓊脂2%，蒸餾水配製，pH60，121℃滅菌15min。（3）生孢子培養基：麥氏培養基。葡萄糖01%，KCl018%，酵母浸膏025%，CH3COONa082%，瓊脂2%，pH自然。115℃滅菌15min。（三）實驗器材試管、離心管、離心機、吸管、培養皿、三角燒瓶、塗布棒等。四、實驗步驟（一）單倍體的雜交（1）取Z1和Z2斜麵菌種1環，分別接種於5mL完全培養基中，28℃靜置培養24h。（2）分別取01mLZ1、Z2菌株培養液，混合接種於5mL完全培養基中，置28℃培養6～8h。在顯微鏡下觀察是否形成啞鈴狀接合子，繼續培養至24h。（二）雜交子的檢出將培養物離心（3500rpm，10min），收集菌體，將菌體用生理鹽水離心洗滌2次，最後懸浮在10mL生理鹽水中。將懸浮液適當稀釋，取01mL塗布於基本培養基平板上。同時做Z1、Z2菌株的對照平板。將全部平板置28℃培養2～4d，觀察每個平板的菌落生長情況。在基本培養基平板上，Z1和Z2菌株不生長，無菌落長出，而塗布有混合培養物的基本培養基平板上有菌落長出，該菌落可認為是雜交子。將其接入完全培養基斜麵中保存，待鑒定。（三）雜交子的驗證（1）將斜麵保存的待測菌株1環接種於5mL完全培養基中，28℃培養24h，重複傳代培養三次。（2）離心收集菌體，用生理鹽水離心洗滌兩次。將菌泥堆放於生孢子培養基平板上，於22～25℃培養2～4d，觀察子囊孢子形成情況，同時做Z1和Z2菌株生孢子對照。如果待測菌株生孢子，即為雜合二倍體菌株（雜交子）。Z1和Z2菌株不生孢子。五、實驗記錄（1）繪製顯微鏡下接合子的形態。（2）雜交子的驗證結果。Z1Z2雜交子基本培養基完全培養基生孢子培養基六、思考題（1）如何獲得酵母菌的單倍體孢子？（2）簡述酵母菌有性雜交的基本過程。
參考文獻
［1］周德慶.微生物學教程［M］.2版.北京：高等教育出版社，2002.
［2］杜連祥，路福平.微生物學實驗技術［M］.北京：中國輕工業出版社，2011.