一、實驗目的
（1）學習平板菌落計數的基本原理和方法。（2）熟練掌握基本無菌操作技術。
二、實驗原理
細菌菌落總數測定一般采用平板菌落計數法，即將一定量待測樣品充分稀釋混勻（使細菌均勻分散），接種到牛肉膏蛋白腖瓊脂平板上，37℃培養一定時間後每個細菌形成肉眼可見的菌落。理論上統計菌落數，根據稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。實際上長出的單菌落可能來自樣品中多個細胞，因此平板菌落計數的結果往往偏低。雖然該計數法操作較煩瑣、時間較長，結果的準確性易受多種因素影響，但其優點在於可以獲得活菌的信息，因此廣泛應用於生物製品檢驗，以及食品、飲料和水樣等含菌指數或汙染度的檢測。
三、實驗器材
（1）試劑和培養基：無菌生理鹽水、磷酸鹽緩衝液、牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基。（2）設備和材料：恒溫培養箱、冰箱、恒溫水浴箱、天平、均質器、振蕩器、精密pH試紙、菌落計數器、無菌吸管（1mL、10mL）或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶（容量250mL、500mL）、無菌培養皿（直徑9cm）。
四、實驗步驟
（一）樣品稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000～10000rpm均質1～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2min，製成1∶10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，製成1∶10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注於盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵），振搖試管或換用1支無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製成1∶100的樣品勻液。製備10倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。根據對樣品汙染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液於無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。及時將15～20mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基（可放置於46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，並轉動平皿使其混合均勻。圖13\|1菌落總數的檢驗程序
（二）培養待瓊脂凝固後，將平板翻轉，36℃±1℃培養48h±2h。水產品30℃±1℃培養72h±3h。（三）菌落計數肉眼觀察，必要時用菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony\|formingunits，CFU）表示。選取菌落數在30～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低於30CFU的平板記錄具體菌落數，大於300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板後乘以2代表一個平板菌落數；當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計。（四）計數若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）樣品中菌落總數結果。若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時，按公式計算：N=C/（n1+01n2）d