一、實驗目的
學習和掌握基於細菌的16SrDNA序列擴增測序、進化樹構建的細菌分子分類鑒定方法。
二、實驗原理
細菌的16SrDNA基因，在分子進化中非常保守，在一定程度上反映細菌的係統發生。所以，細菌的16SrDNA序列，經常與細菌的形態特征和生理生化特征結合，被用於微生物的鑒定及其分類地位的確定。微生物含有3個rRNA分子：23S，16S和5S，它們序列長度分別為2900，1540，120nt。其中16SrRNA分子量適中，含有較大信息量，堿基順序保守性強且穩定，是鑒別生物間進化關係的重要分子，也是研究生物係統進化過程的分子鍾。16SrRNA的序列分析表明它在種以上微生物相關性具有很高的分辨力。
三、實驗器材
（1）菌株：耐輻射嗜熱菌AnoxybacillusS1。（2）培養基：胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂20g/L，調pH值為80，121℃滅菌20min。（3）主要試劑：EDTA緩衝液、SDS、NaAc、CTAB、酚\|氯仿\|異戊醇（25∶24∶1）、TE溶液、10×PCRbuffer、6×Loadingbuffer、Mg2+buffer、dNTP、DNA分子量標準、TaqDNApolymerase、RNaseA、蛋白酶K、溶菌酶、核酸酶P1、無水乙醇、瓊脂糖、胰蛋白腖、酵母提取物、瓊脂。（4）試劑盒：UNIQ\|10柱式通用DNAPurificationKit，EZ\|10SpinColumnPCRProductPurificationKit。（5）細菌16SrDNA引物：27F：5′\|AGAGTTTGATCATGGCTCAG\|3′；1541R：5′\|AAGGAGGTGATCCAGCCGCA\|3′。（6）分析軟件：DNASTAR71、MEGA40和ClustalX181，用於DNA序列的分析、同源性比較及係統發育樹分析等。（7）主要儀器：試管、三角瓶、量筒、天平、15mL微量離心管、PCR反應管、移液槍、電熱恒溫水槽、渦旋振蕩器、pH計、壓力蒸汽滅菌器、超淨工作台、恒溫調速回轉式搖床、高速台式冷凍離心機、PCR儀、製冰機、低溫冰箱、瓊脂糖凝膠電泳係統、凝膠掃描儀。
四、操作步驟
（一）細菌基因組DNA的提取（二）菌體的獲得將耐輻射嗜熱菌AnoxybacillusS1接種於滅過菌的培養基中，55℃，150r/min振蕩培養24h，4℃，12000rpm離心10min收集菌體。（三）CTAB法抽提基因組DNA（1）收集好的細菌培養物移至15mL無菌離心管中，加入1mL無菌水，12000rpm離心5min，去除上清液；加入200μL無菌蒸餾水洗滌1次，4℃，12000rpm，離心5min，然後去除上清液。（2）加入200μLEDTA緩衝液，重新懸浮細胞，混勻，4℃，12000rpm，離心10min洗滌，去除上清液；重複一次。（3）用200μLEDTA緩衝液重新懸浮細胞，加入3μL溶菌酶溶液（20mg/mL），2μLRNaseA溶液（10mg/mL），混勻，37℃孵育40min。（4）加入3μLProteinaseK溶液（10mg/mL），37℃孵育60min。（5）加入20μL25%SDS溶液，65℃溫育10min。（6）加入45μL5mol/LNaAc溶液和30μL2%CTAB溶液，混合均勻。（7）加入等體積的酚\|氯仿\|異戊醇（25∶24∶1），4℃，12000rpm離心5min，得上清液。（8）上清液轉移至新的15mL無菌離心管中，重複（7）一次。（9）取上清液，加入2倍體積的無水乙醇（預冷），混勻，－20℃下靜置20～30min，4℃，12000rpm，離心5min，輕輕去除上清液。（10）沉澱加入1mL70%乙醇溶液洗滌，4℃，10000rpm，離心2min，重複一次，徹底去除上清液。室溫下將沉澱物中殘留的乙醇吹幹，直至沉澱變成透明；加入50μLTE溶液溶解，－20℃保存備用。（四）基因組DNA純化采用通用DNAPurificationKit，UNIQ\|10柱。（1）按每100μLDNA溶液加100μLBindingBufferⅡ，混勻，放置2min。（2）全部轉移到UNIQ\|10柱，柱子放入20mLCollectionTube，室溫放置2min後，10000rpm室溫離心30s。（3）取下UNIQ\|10柱，棄去離心管中的廢液。將柱子放回同一根離心管中，加入500μLWashSolution，10000rpm室溫離心30s。（4）重複步驟（3）一次。（5）取下UNIQ\|10柱，棄去離心管中的全部廢液。將柱子放回同一根離心管中，10000rpm室溫離心30s，以除去殘留的WashSolution。（6）將柱子放入新的幹淨15mL離心管中，在柱子中央加入50mLElutionBuffer，室溫放置2min，提高洗脫液的溫度至55～80℃有利於提高DNA的洗脫效率。（7）10000rpm室溫離心1min。收集管中的液體即為純化的DNA，可立即使用或保存-20℃備用。（五）基因組DNA的檢測采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的長度和純度。（1）灌膠模具的準備：將灌膠模具、梳子清洗幹淨晾幹，然後調平灌膠板。（2）瓊脂糖膠的配製：先配製足夠用於灌滿電泳槽和製備凝膠所需的電泳緩衝液1×TAE（母液為50×TAE），然後準確稱取所需瓊脂糖放入錐形瓶中，加入一定量的電泳緩衝液，用稱量紙包於瓶口，於微波爐中熔膠至清澈、透明的溶液狀。（3）製膠：在熔好的膠中加入EB（溴化乙啶，終濃度為05g/mL）2～3滴，輕輕充分搖勻，待其冷卻到50～60℃時倒膠，插入梳子，凝膠厚度一般為03～05cm，在錐形瓶中加入部分水，置於EB台上。（4）凝膠：完全凝固後（於室溫放置20～30min），在梳子齒附近加入少量電泳緩衝液，然後緩慢輕輕地向上拔掉梳子，把碎膠衝幹淨，將凝膠放入電泳槽中。（5）電泳前的準備：在電泳槽中加入電泳緩衝液（1×TAE），使其恰好沒過膠麵約1mm。（6）點樣：加入DNAMarker，將上樣緩衝液（6×LoadingBuffer）和樣品以1∶5的比例混勻點樣。（7）電泳：加好樣後蓋上蓋子，打開電源，電壓調至85V，電泳60min，在溴酚藍指示距膠末端1/5膠長度時停止電泳。（8）結果觀察：將電泳後的凝膠放在凝膠成像係統中進行拍照觀察。（六）PCR擴增16SrDNA序列（1）擴增的反應體係（50μL）10×PCRBuffer5μLMgCl2（25mM）3μLdNTP1μL正向引物27F1μL反向引物1541R1μLDNA模板2μLTaq酶05μLddH2O補至50μL（2）依照下列程序進行PCR擴增：采用細菌通用引物進行16SrDNA的PCR擴增。依照下列程序進行。94℃5min94℃