一、實驗目的
學習ITS序列分析法鑒定真菌的原理和方法
。二、實驗原理
傳統的真菌分類鑒定主要是按照真菌的形態、生長以及生理生化等特征進行分類。然而真菌的種類繁多，個體多態性明顯，而且其生長、生理生化特征也會隨著環境的變化而不穩定。因此，采用傳統的方法對真菌進行正確分類存在較大的困難。隨著分子生物學技術的發展，核酸序列分析已被廣泛地應用於真菌分類鑒定，目前常用的技術包括18SrDNA、ITS（InternalTranscribedSpacer，ITS）及18SrDNA\|ITS序列分析技術。真核生物核糖體RNA（rRNA）有5、58、17～18（以下統稱為18S）和25～28S（以下統稱為28S）。對於大多數真核生物來說，核糖體rRNA基因群的一個重複單位（rDNA）包括以下區段（按5′→3′方向）：①非轉錄區（NonTranscribedSequence）簡稱NTS；②外轉錄間隔區（ExternalTranscribedSpacer），簡稱ETS；③18SrRNA基因，簡稱18SrDNA；④內轉錄間隔區1（InternalTranscribedSpacer1），簡稱ITS1；⑤58SrRNA基因，簡稱58SrDNA；⑥內轉錄間隔區2（InternalTranscribedSpacer2），簡稱ITS2；⑦28SrRNA基因，簡稱28SrDNA。ITS1和ITS2常被合稱為ITS，並且58SRNA基因也被包括在ITS之內。圖20\|1真菌rDNA轉錄區和相關引物
rDNA上的58、18和28SrRNA基因有極大的保守性，即存在著廣泛的異種同源性。而由於ITS區不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異。在絕大多數的真核生物中表現出極為廣泛的序列多態性，即使是親緣關係非常接近的2個種都能在ITS序列上表現出差異，顯示最近的進化特征。研究表明，ITS片段的進化速率是18SrDNA的10倍。這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎。ITS1和ITS2是中度保守區域，其保守性基本表現為種內相對一致，種間差異比較明顯。這種特點使ITS適合於真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的係統發育關係分析。由於ITS的序列分析能實質性地反映屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，此外ITS序列片段較小、易於分析，目前已被廣泛應用於真菌屬內不同種間或近似屬間的係統發育研究。ITS序列分析通常通過多聚酶鏈式反應（PCR）技術實現，根據rDNA基因上高度保守區段設計通用引物（引物ITS1和ITS2用於擴增18SrDNA和58SrDNA之間的轉錄間隔區ITS1，引物ITS3和ITS4用於擴增58SrDNA和28SrDNA之間的轉錄間隔區ITS2），借助PCR技術擴增rDNA的目的片段。通常ITS的擴增產物是多種片段的混合物，可以通過克隆實現分離，然後對每一個克隆測序，也可以通過電泳分離獲得所需長度的條帶膠回收後直接測序。然後借助於詳細的序列對比，分析被試菌種與基因序列庫中已知菌種的同源性。
三、實驗器材
（一）菌種黑曲黴（Aspergillusniger）、米曲黴（Aspergillusoryzae）、醬油曲黴（Aspergillussojae）等曲黴菌種。
（二）實驗儀器PCR擴增儀、微量移液器、水浴鍋、低溫離心機、電泳儀、電泳槽、凝膠成像係統、超低溫冰箱、超純水生成器、紫外分光光度計等。
（三）實驗試劑
1.酶和試劑盒真菌DNA基因組提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、小量瓊脂糖膠回收試劑盒、DNAmarker（DL2000DNAmarker）、Taqpolymerase、RNase、PCR引物（引物設計後由公司合成，序列如表20\|1）。表20\|1真菌rDNA\|ITS通用擴增引物PrimerSequence（5′to3′）Length（bp）ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG19ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC20ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC20ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC202.主要溶液及培養基液氮，TE緩衝液（pH75），石蠟油，10%SDS，苯酚，氯仿，異戊醇，異丙醇，NaOH溶液，PBS緩衝液，Tris\|硼酸\|EDTA緩衝液，瓊脂糖，005%溴酚藍－50%甘油溶液（5×LoadingBuffer），05μg/mL溴化乙啶染色液等。部分溶液的配製方法如下。土豆培養基（PDA）：稱取土豆（去皮）200g，切碎放入水中煮30min，紗布過濾，在所得的土豆汁中加入葡萄糖（或蔗糖）20g，再加水至1000mL，pH自然。TE緩衝液：10mmol/LTris\|HCl（pH75），1mmol/LEDTA（pH80），121℃高壓滅菌20min，備用。其中1mmol/LEDTA（pH80）：稱取1211gEDTA\|Na2溶於800mL去離子水中，劇烈攪拌，用NaOH粉末調節pH值至80，加水定容至1L，分裝至121℃高壓滅菌20min，4℃冰箱貯存。10×TBE緩衝液（pH83）：Tris10789g，EDTA744g，溶於800mL水中，緩慢加入硼酸，pH為83，定容至1000mL。Tris\|硼酸\|EDTA緩衝液（TBE緩衝液），pH83：稱取1078gTris，550g硼酸，093gEDTA\|Na2溶於去離子水，定容至1000mL。DNA提取液（EDTA濃度125mmol/L）：1mol/LTris\|HCl10mL與05mol/L的EDTA25mL混合，定容至100mL。磷酸鹽緩衝溶液（PBS）：在800mL蒸餾水中溶解8gNaCl，02gKCl，144gNa2HPO4和024gKH2PO4，用HCl調節溶液pH值至74，加水定容至1000mL，高壓滅菌。氯仿\|異戊醇（24∶1）：將24倍體積的氯仿與1倍體積的異戊醇混合。10%SDS（W/V）：10gSDS溶於75mL水中，60℃助溶，調pH值至70～72，定容至100mL。005%溴酚藍-50%甘油溶液（5×LoadingBuffer）：取一定量的01%溴酚藍水溶液，與等體積甘油混合而成。05μg/mL溴化乙啶染色液：稱取5mg溴化乙啶，用去離子水溶解，定容至100mL。從中取1mL，用無離子水稀釋至100mL。（注意：有毒，戴手套，通風櫃內進行。）