現代微生物學實驗指導-正文實驗二十三物理誘變構建鏈黴菌高產突變庫

一、實驗目的

（1）學習和掌握紫外誘變育種的方法及測定誘變劑最適劑量的方法。（2）了解60Co\|γ輻照誘變的原理和方法。（3）掌握瓊脂塊法篩選突變株的方法。

二、實驗原理

輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。當通過輻射將能量傳遞到生物體內時，生物體內各種分子便產生電離和激發，接著產生許多化學性質十分活躍的自由原子或自由基團。它們繼續相互反應，並與其周圍物質特別是大分子核酸和蛋白質反應，引起分子結構的改變。由此又影響到細胞內的一些生化過程，如DNA合成的中止、各種酶活性的改變等，使各部分結構進一步深刻變化，其中尤其重要的是染色體損傷。由於染色體斷裂和重接而產生的染色體結構和數目的變異即染色體突變，而DNA分子結構中堿基的變化則造成基因突變。那些帶有染色體突變或基因突變的細胞，經過細胞世代將變異了的遺傳物質傳至性細胞或無性繁殖器官，即可產生生物體的遺傳變異。紫外線是一種最常用有效的物理誘變因素，其誘變效應主要是由於它引起DNA結構的改變而形成突變型。紫外線誘變，一般采用15W或30W紫外線燈，照射距離為20～30cm，照射時間依菌種而異，一般為1～3min，死亡率控製在50％～80％為宜。被照射處理的細胞，必須呈均勻分散的單細胞懸浮液狀態，以利於均勻接觸誘變劑，並可減少不純種的出現。同時，對於細菌細胞的生理狀態則要求培養至對數期為最好。60Co\|γ輻照誘變，一般將菌種的單孢子懸液置於不同劑量的60Co\|γ射線當中，照射適當的時間，將處理液適當的稀釋，塗布於抗性平板上，進行有目的的篩選。在產量性狀誘變育種中，誘變處理後的微生物群體中，將會出現各種突變類型的個體，但其中絕大多數個體是負向突變。要將其中極少數的產量提高較為顯著的正向突變個體篩選出來確實是比較困難的。為了花最少時間、最少的工作量取得最大的成效，就要設計和采用效率較高的篩選方案和適宜的篩選方法。瓊脂塊法是篩選菌株工作中一種基本而又重要的方法。它是通過對誘變之後抗性平板上長出來的若幹單菌落進行打孔，培養，然後在檢測平板上所形成的抑菌圈大小初步篩選菌株。這種方法可為之後的篩選工作減少壓力，提高篩選的效率，減少篩選的盲目性。

三、實驗材料及儀器

（一）出發菌株出發菌種：鏈黴菌（Streptomycesfungicidious）。檢定菌：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）ATCC6633。

（二）培養基（1）鏈黴菌活化培養基：可溶性澱粉2%，NaCl005%，KNO301%，K2HPO4·3H2O005%，MgSO4·7H2O005%，FeSO4·7H2O00001%，瓊脂2%，pH74～76。（2）培養基Ⅰ：蛋白腖1%，牛肉浸出粉05%，NaCl025%，瓊脂15%，pH64～66。（3）培養基Ⅱ：蛋白腖05%，牛肉浸出粉05%，NaCl08%，Na2HPO402%，瓊脂15%，pH79～81。（4）種子培養基：玉米漿35%，可溶性澱粉30%，玉米蛋白粉05%，CaCO320%，pH70。（5）發酵培養基：葡萄糖40%，玉米澱粉20%，玉米漿20%，玉米蛋白粉30%，NH4Cl05%，NaCl15%，CaCO315%，pH70～72。葡萄糖與玉米澱粉單獨滅菌，使用前與其他培養基成分混合。

（三）儀器高速冷凍離心機、恒溫調速回轉式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、人工培養箱鼓風幹燥箱等。四、實驗步驟（1）單孢子懸液的製備：取單菌落的產恩拉黴素鏈黴菌的孢子在高氏Ⅰ號培養基上劃線，於28℃培養7d。然後用15mL無菌生理鹽水洗下孢子，倒入無菌三角瓶中，置於磁力攪拌器上，使孢子分散，用無菌脫脂棉過濾得到單孢子懸液。采用血球計數板法，調整單孢子懸浮液中孢子濃度為108個/mL。（2）最小抑菌濃度實驗：將製備的單孢子懸液用10倍稀釋法，依次稀釋10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7幾個梯度，分別取200μL塗布於添加01%，02%，03%，04%，05%濃度的恩拉黴素的高氏Ⅰ號平板上，對照組平板不添加，置28℃培養7d。（3）紫外誘變：取10mL單孢子懸液於培養皿中（帶磁力攪拌棒），置於誘變箱磁力攪拌器上，開啟紫外燈，預熱20min後，開啟磁力攪拌器，打開皿蓋，分別照射15，30，45，60，75，90s。取不同時間段誘變處理液1mL，做適當稀釋，測定處理液中存活細胞濃度（每時間做3個稀釋度，每1稀釋度做3皿平行）。孢子懸浮液進行適當稀釋後塗布於加有比最小抑菌濃度大3倍的恩拉黴素的高氏Ⅰ號平板上，並且同時塗布空白平板上，置28℃培養3d。（4）60Coγ輻照誘變：取新鮮製備的菌株單孢子懸液，離心沉澱後重新懸浮於適量無菌水中，分裝3管以300Gy、500Gy、700Gy的輻照劑量進行60Coγ射線輻照。輻照完成之後將孢子懸浮液進行適當稀釋後塗布於加有比最小抑菌濃度大3倍的恩拉黴素的高氏Ⅰ號平板上，並且同時塗布空白平板上，置28℃培養3d。（5）致死率和突變率計算：致死率（%）=（未經誘變培養基中菌落總數－誘變培養基中菌落總數）/未經誘變培養基中菌落總數×100%正突變率（%）=誘變篩選具有活性產物的突變體總數/誘變篩選挑取的菌落總數×100%負變異率（%）=誘變篩選活性較對照菌株低的突變體總數/誘變篩選挑取的菌落總數×100%（6）瓊脂塊初篩法：用滅過菌的8mm孔徑的打孔器將已培養3d的單菌落打下，打下之後的瓊脂塊置於無菌的恒溫恒濕小室中培養7d，放置於含有2%檢定菌的瓊脂平板上37℃培養16～18h，測定抑菌圈大小，如圖23\|1所示。以出發菌株為對照。圖23\|1瓊脂塊初篩示意