一、實驗目的通過基因組重排技術與核糖體工程相結合，選育阿維拉黴素生產菌株。
二、實驗原理阿維拉黴素（Avilamycin）又稱卑黴素、阿美拉黴素、肥拉黴素，是由綠色產色鏈黴菌（Streptomycesviridoehrongenes）菌株發酵而成的二氯異扁枝衣酸酯，屬於正糖黴素族的寡糖類抗生素，主要抑製革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌效果較差，是一種新型消化促進劑和代謝調節劑。基因組重排技術是通過原生質體融合達到全基因組片段交換、重組的目的，之後再經多輪遞歸融合將正向突變表型聚集於高產菌株中。原生質體融合在多親本的條件下其重組效率很低，多輪遞歸融合基因組重排具有高效性。原生質體遞歸融合過程，包括製備原生質體（主要參考因素有菌齡、酶解濃度、酶解溫度和時間），融合和再生原生質體（主要參考因素有助融劑的選擇、高滲溶液和再生培養基的設計等）。其過程主要包括：①獲取一個含有各種不同正突變的基因庫；②製備原生質體；③誘導原生質體遞歸融合；④設計特殊的選擇性培養基。本實驗先經過60Coγ誘變得到基因型不同的多株出發菌株，再由此進行多輪原生質體融合，從而通過基因組重排以獲得高產菌株。進化壓力的選擇是基於核糖體工程的育種思想而設計。三、實驗器材（一）菌種綠色產色鏈黴菌Streptomycesviridochromogenes41119，60Coγ誘變高產菌株1\|16、1\|17、1\|19。藤黃微球菌（Microccusluteus10209）。圖24\|1育種路線圖
（二）培養基（1）鏈黴菌活化培養基：KNO310g/L，可溶性澱粉200g/L，K2HPO405g/L，MgSO4·6H2O05g/L，FeSO4·7H2O001g/L，NaCl05g/L，Agar200g/L，pH72～74。（2）再生培養基：KH2PO40025%，蔗糖103%，MgC12·6H2O112%，葡萄糖10%，蛋白腖001%，酵母浸出粉05%，微量元素溶液02mL/100mL，TES10mL/100mL，瓊脂20%。分裝250mL於500mL錐形瓶中，然後各加入單獨滅菌的KH2PO4（05%），CaC12·2H2O（25M）和NaOH（10M）分別為25mL，20mL和175mL。（3）鏈黴菌發酵基本培養基：可溶性澱粉200g/L，豆粕粉200g/L，大豆蛋白腖50g/L，D\|木糖70g/L，L\|纈氨酸20g/L，CaCO305g/L，MgSO405g/L，微量元素。pH72～74。（4）牛肉膏蛋白腖液體培養基：牛肉膏30g/L，蛋白腖100g/L，NaCl50g/L，pH70～72。（5）牛肉膏蛋白腖半固體培養基：牛肉膏30g/L，蛋白腖100g/L，NaCl50g/L，瓊脂100g/L，pH70～72。（6）牛肉膏蛋白腖固體培養基：牛肉膏30g/L，蛋白腖100g/L，NaCl50g/L，瓊脂200g/L，pH70～72。（三）藥品與試劑可溶性澱粉、葡萄糖、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉、磷酸二氫鉀、蔗糖、氯化鎂、蛋白腖、酵母浸出粉、氯化鈣、氫氧化鈉、豆粕粉、大豆蛋白腖、D\|木糖、牛肉膏、L\|纈氨酸、碳酸鈣、氯化錳、PEG6000、甲醇、乙腈、乙酸銨。（四）溶液（1）微量元素：ZnCl240mg，FeCl3·6H2O200mg，CaCl2·2H2O10mg，MnCl2·4H2O10mg，NaB4O7·10H2O10mg，（NH4）6M7O24·4H2O10mg，加入至1000mL蒸餾水中。（2）高滲溶液PB：蔗糖103g，K2SO40025g，MgC12·6H2O0202g，微量元素溶液02mL，用去離子水定容到88mL，滅菌；再加入單獨滅菌的KH2PO4（05%），CaC12·2H2O（25M）和TES各100mL。（3）TES緩衝液：Tris\|HCl（pH80）10mM，EDTA1mM，SDS01mM。（4）酶溶液：稱取02g溶菌酶溶解在100mLPB液中，配製成濃度為02%的酶溶液。（五）主要儀器設備SORVALLRC6型高速冷凍離心機、DYK\|Ⅱ恒溫調速回轉式搖床、XDD型電熱立式壓力蒸汽消毒器、無菌操作台、DK\|8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）、移液槍、分析天平、pH計、高效液相色譜儀（惠普公司）。四、實驗步驟（一）阿維拉黴素產生菌的誘變育種（1）誘變及篩選流程：凍幹管→液體活化培養基→平板稀釋塗布→單孢子斜麵→單孢子懸液→60Coγ誘變→稀釋塗布於含阿維拉黴素的平板→單菌落→瓊脂塊初篩→轉接斜麵→搖瓶發酵複篩→正突變株→保藏。（2）孢子懸液的製備：新鮮的正突變株孢子斜麵中加入5mL的無菌生理鹽水，用接種棒將孢子刮下，轉入無菌離心管中，再用5mL無菌生理鹽水洗斜麵一次，並轉入無菌離心管，用無菌脫脂棉過濾，得單孢子懸液。（3）阿維拉黴素最小抑菌濃度實驗：將製備的單孢子懸液用10倍稀釋法，依次稀釋10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7幾個梯度，分別取200μL塗布於添加01%，02%，03%，04%，05%濃度鏈黴素的平板，對照組平板不添加，於28℃培養7d。（二）融合前菌種培養（1）將60Coγ誘變得到的高產正菌株單孢子懸液接種於裝有100mL種子培養基的500mL三角瓶中（含有05g甘氨酸和少量玻璃碎片），28℃，120r/min振蕩培養36～48h。（2）用顯微鏡觀察是否染菌。（3）移取5mL上述種子液到10mL的無菌離心管中，6000rpm，離心10min。去上清液，收集菌絲體。加入5mL無菌水，振蕩均勻後倒入到裝有一定量玻璃碎片和10mL蒸餾水的100mL滅菌三角瓶中，在150r/min，振蕩30min，使成團的菌絲體打碎分散開。（4）振蕩結束後，吸取5mL菌液到10mL無菌離心管中，6000rpm離心10min，棄去上清液。（5）在上述10mL離心管中加入5mLPB液，用移液槍吹吸均勻，洗滌菌絲體，離心棄上清，重複一次，然後將菌絲體懸浮於5mLPB液中，按下述步驟進行原生質體的製備。（三）原生質體製備（1）將上述製備得到的菌絲體在6000rpm離心10min，棄去上清液。（2）在上述離心管中加入5mL02%（g/mL）的溶菌酶，用移液槍吹均勻，於30℃的水浴振蕩酶解2h，使菌體充分懸浮在酶液中。原生質體的形成情況可用顯微鏡跟蹤觀察。酶解結束後，再用移液槍吹吸幾次，以使形成的原生質體從菌絲體中釋放出來。（3）用帶有脫脂棉的一次性針筒過濾酶解液，收集濾液。在2000rpm轉速下離心15min，去除酶液，沉澱得原生質體。（4）用5mLPB液洗滌原生質體一次，以洗淨酶液。（5）離心棄去上清液，然後用5mLPB液重新懸浮原生質體，用移液槍吹吸均勻；再用PB液稀釋一定濃度，在血球計數板上計數原生質體。（6）用PB液配製成約107個/mL的原生質體溶液。（四）原生質體融合（1）將不同菌株的原生質體懸液各取1mL於10mL的無菌離心管中，1500rpm，離心15min，棄去上清液。（2）加入40%的聚乙二醇（PEG6000），用移液槍吹吸均勻，懸浮原生質體，盡可能讓促融劑PEG把原生質體包裹起來。25℃靜置融合20min。（3）2500rpm，離心10min，沉澱原生質體，棄去上清液。再用PB液洗滌一次，1500rpm離心15min，棄去上清液。（4）加入5mLPB液懸浮原生質體融合液。（五）原生質體再生（1）取經過適當稀釋後的原生質體融合懸液01mL加於含有一定濃度鏈黴素的再生平板上（再生平板使用前需在37℃培養箱中預培養1d，或是在65℃的烘箱中烘30min，以保證固體培養基表麵水分充分蒸發，減少由於再生培養基表麵的冷凝水引起的原生質體破裂）。（2）將塗布好的培養皿倒置於28℃的培養箱中培養6～15d，觀察再生結果。待再生雙層平板上長出菌落，計再生菌落數（A）。（3）取與上述相同量的原生質體用無菌水稀釋相同的倍數，然後取01mL懸液塗布於再生平板上，待菌落長出後，計菌落數（B）。（4）取與上述相同量的未酶解之前的菌絲體懸液，用PB液稀釋相同的倍數後取01mL菌絲體懸液塗布於平板上，待菌落長出後，記菌落數（C）。（5）原生質體製備率和再生率的計算：再生率＝（A－B）/（C－B）×100%製備率＝（C－B）/C×100%A：原生質體用PB液稀釋後塗布再生雙層平板存活的菌落數；B：原生質體用無菌水稀釋後塗布再生雙層平板存活的菌落數；C：酶解前菌絲體塗布平板長出的菌落數。（六）基因組重排按上述方法進行第一次原生質體融合再生後，挑取長出的單菌落進行初篩及搖瓶發酵實驗，測其效價，並取效價高於原始菌株的菌株作為下一輪融合的對象，進行原生質體融合再生，所得菌株即為第二輪融合後的菌株。如此反複進行3～5輪重複的循環原生質體融合，鏈黴素抗性壓力不斷增大。融合子代標記依序為F1、F2、F3、F4、F5。（七）重組菌株的穩定性將發酵複篩得到的高產重組菌株按斜麵傳代的方法，連續傳接五代，將每代的斜麵按上述發酵複篩的方法進行複篩，測定發酵液中阿維拉黴素的效價，來確定重組菌株高產特性的遺傳穩定性。（八）阿維拉黴素效價測定1.生測法檢測阿維拉黴素產量將滅菌後的牛肉膏蛋白腖固體培養基倒入已滅菌的平皿中（每個平皿15mL左右），室溫下自然凝固，作為平板的下層。指示菌Microccusluteus在液體培養基