一、實驗目的（1）了解基因定點突變在基因功能研究和微生物育種中的應用。（2）掌握微生物基因定點突變的原理和操作方法。
二、實驗原理
綠色熒光蛋白（GFP）是一類存在於包括水母、水蛭和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白。它的相對分子量為30×103kDd，受395nm近紫外光或470nm藍光激發後，在Ca2+催化下，能發出波長為510nm的綠色熒光。GFP基因來源於水母，表達綠色熒光蛋白，檢測時不需要外源底物或輔助因子，且具有可以活體觀察、靈敏度高、無毒害、結構穩定、作用持久等優點，可用以檢測基因表達和在活細胞裏定位蛋白質，實現在體內實時檢測標記菌株的研究。定點突變是指通過聚合酶鏈反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質粒）中引入所需的突變（通常是有利表型方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效地提高DNA所表達的目的蛋白的性狀，是基因研究工作中一種非常有用的手段。定點突變一般要求含有待突變基因的高純度質粒，不少於10μg，電泳圖清晰，達到酶切與測序要求。定點突變的一般步驟如下：（1）對待突變基因測序結果進行分析，設計突變方案。（2）根據突變方案設計合成覆蓋突變位點的雙向引物，合成目的DNA序列兩端引物，進行高保真PCR反應（圖27\|1）。（3）將PCR產物克隆至T載體，或者根據要求亞克隆至目的載體；DNA測序驗證突變序列的正確性。GFP由238個氨基酸殘基組成，其中65—67位殘基（Ser65\|Tyr66\|Gly67）可自發形成熒光發色基因（對羥基苯並咪唑啉硐）。本實驗通過定點突變將GFP的Tyr66轉變成His66（Y66H），從而使GFP可以顯示藍色熒光。圖27\|1Quickchange基因定點突變示意
三、實驗材料（一）菌株與質粒（1）大腸杆菌（E.coli）DH5α。（2）質粒pET\|GFP、pMD\|18T等。（二）試劑（1）1000×氨苄青黴素（Ampicillin）：100mg/mL氨苄青黴素鈉鹽溶於去離子水，後過濾除菌，並分裝保存於－20℃冰箱。（2）LB培養基：酵母浸出粉05%，蛋白腖1%，NaCl1%，瓊脂15%，調pH72。滅菌後，等瓊脂培養基冷卻到60℃，加入1mL1000×Ampicillin，後倒平板。（3）SOC培養基：胰蛋白腖2%，酵母浸出粉05%，NaCl005%，25mmol/LKCl，10mmol/LMgSO4，20mmol/L葡萄糖。葡萄糖單獨配製，過濾除菌，用前按量（每20mL溶液1mg葡萄糖）加入培養基中。用10MNaOH調節pH至70。（三）寡聚核苷酸引物（1）用於Y145F突變的引物：GFP_Y145F\|F：CACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACGTC；GFP_Y145F\|R：GACGTTGTGGCTGTTGAAGTTGTACTCCAGCTTGTG。（2）用於Y66H突變的引物：GFP_Y66H\|F：GTGACCACCCTGACCCACGGCGTGCAGTGCTTC；GFP_Y66H\|R：GAAGCACTGCACGCCGTGGGTCAGGGTGGTCAC。（四）工具酶DNA限製酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、RNaseA等。（五）其他試劑瓊脂糖、IPTG、X\|gal、SDS、TEMED、Tris、dNTP、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、低熔點瓊脂、分子量標誌物（2kbLadder）等。（六）儀器設備恒溫培養箱、超淨工作台、恒溫搖床、PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像儀、冷凍離心機、超低溫冰箱、精密酸度計等。四、實驗內容（一）GFP定點突變（第1天）（1）將02mL管置於冰上，根據下表配製PCR主混液。所有不是酶的試劑需在室溫下溶解，酶需在用時臨時從冰箱中取出。主混液在振蕩器上混勻，並離心機上短時間離心使液體沉於管底。表27\|1PCR主混液（46μLforafinalof50μL）質粒模板（eGFP+Y145F）4μL（10ng）Pfu緩衝液（10×）5μL（1×）dNTP（各10mM）1μL（02mM）PfuDNA聚合酶（2U/μL）05μL（002U/μL）ddH2O395μL（upto50μL）（2）用移液器轉移23μL主混液到另一個02mLPCR管。（3）在一個PCR管中各加入2μL正向引物（Y66H\|F，5μM），在另一個PCR管中加入2μL反向引物（Y66H\|R，5μM）。（4）將兩個樣品置於PCR儀進行PCR反應。PCR反應程序如下：每一步PCR（循環數：3）Initialdenaturation30″98℃Denaturation10″98℃Annealing30″60℃Elongation90″72℃（5）再混合兩個PCR管，振蕩混勻，後分成兩管（2×25μL）再PCR。每二步PCR（循環數：20）Initialdenaturation30″98℃Denaturation10″98℃Annealing30″60℃Elongation90″72℃Finalelongation3′72℃（6）PCR產物電泳觀察。配製08%Agarose\|gel：混合5μL染料（GelRed）與50mL1×TAE電泳緩衝液。上樣：DNALadder。混合10μLPCR產物與2μL含染料上樣Buffer。混合5μL空質粒與2μL含染料上樣Buffer。電泳條件：電壓90V，時間30min。在紫外燈下觀察電泳結果。（7）DpnⅠ酶解在PCR產物（50μL）中加入1μLDpnⅠ，並37℃水浴過夜。（二）突變體克隆與轉化（第2天）（1）將低溫保存的分裝好的E.coliDH5α（100μL）融化備用。（2）水浴鍋溫度設為42℃。（3）加4μL（10～50ng）PCR產物（p\|eGFPY145F+Y66F）到100μLE.coliDH5α。（4）再加入2μL空載體（pET\|GFP）。（5）將混合物管放在冰上放置15min。（6）後將管置於水浴中40sec。（7）將管放在冰中2min。（8）在每個混合物中加入09mLSOC培養基，並37℃水浴60min，並250r/min振蕩。（9）離心（16000g）1min，去除800μL上清液，後合剩下的200μL重新懸浮。（10）將此200μL塗布於LB\|Amp平板，並置於37℃過夜。五、實驗結果記錄通過UV燈檢測LB抗性平板上生長的菌落。藍色的克隆代表定點突變（Y66H）在eGFP\|Y145F是成功的。綠色克隆代表PCR所用的模板DNA還沒有被酶DpnⅠ完全消化。拍照記錄轉化菌株的熒光照片。圖27\|2突變克隆的觀察