現代微生物學實驗指導-正文附錄一食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數

一、範圍本標準規定了食品中大腸菌群（Coliforms）計數的方法。本標準適用於食品中大腸菌群的計數。二、術語和定義（一）大腸菌群Coliforms在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌。（二）最可能數mostprobablenumber，MPN基於泊鬆分布的一種間接計數方法。三、設備和材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。1.恒溫培養箱：36℃±1℃。2.冰箱：2℃～5℃。3.恒溫水浴箱：46℃±1℃。4.天平：感量01g。5.均質器。6.振蕩器。7.無菌吸管：1mL（具001mL刻度）、10mL（具01mL刻度）或微量移液器及吸頭。8.無菌錐形瓶：容量500mL。9.無菌培養皿：直徑90mm。10.pH計或pH比色管或精密pH試紙。11.菌落計數器。四、培養基和試劑1.月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。2.煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。3.結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。4.磷酸鹽緩衝液：見附錄A中A.4。5.無菌生理鹽水：見附錄A中A.5。6.無菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。7.無菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。第一法大腸菌群MPN計數法五、檢驗程序大腸菌群MPN計數的檢驗程序見圖1。圖1大腸菌群MPN計數法檢驗程序

六、操作步驟（一）樣品的稀釋1.固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min～10000r/min均質1min～2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，製成1∶10的樣品勻液。2.液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，製成1∶10的樣品勻液。3.樣品勻液的pH值應在65～75之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調節。4.用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反複吹打，使其混合均勻，製成1∶100的樣品勻液。5.根據對樣品汙染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從製備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。（二）初發酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行複發酵試驗，如未產氣則繼續培養至48h±2h，產氣者進行複發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。（三）複發酵試驗用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。（四）大腸菌群最可能數（MPN）的報告按（三）確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。第二法大腸菌群平板計數法七、檢驗程序大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖2。圖2大腸菌群平板計數法檢驗程序

八、操作步驟（一）樣品的稀釋按6.1進行。（二）平板計數1.選取2～3個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。2.及時將15～20mL冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固後，再加3～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置於36±1℃培養18～24h。（三）平板菌落數的選擇選取菌落數在15～150CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為05mm或更大。（四）證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於BGLB肉湯管內，36±1℃培養24～48h，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。（五）大腸菌群平板計數的報告經最後證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（三）中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100×6/10×104/g（mL）=60×105CFU/g（mL）。附錄A（規範性附錄）培養基和試劑（一）月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯1.成分胰蛋白腖或胰酪腖200g氯化鈉50g乳糖50g磷酸氫二鉀（K2HPO4）275g磷酸二氫鉀（KH2PO4）275g月桂基硫酸鈉01g蒸餾水1000mLpH68±022.製法將上述成分溶解於蒸餾水中，調節pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。（二）煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯1.成分蛋白腖100g乳糖100g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL01%煌綠水溶液133mL蒸餾水800mLpH72±012.製法將蛋白腖、乳糖溶於約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將200g脫水牛膽粉溶於200mL蒸餾水中，調節pH至70～75），用蒸餾水稀釋到975mL，調節pH，再加入01%煌綠水溶液133mL，用蒸餾水補足到1000mL，用棉花過濾後，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。（三）結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）1.成分蛋白腖70g酵母膏30g乳糖100g氯化鈉50g膽鹽或3號膽鹽15g中性紅003g結晶紫0002g瓊脂15g～18g蒸餾水1000mLpH74±012.製法將上述成分溶於蒸餾水中，靜置幾分鍾，充分攪拌，調節pH。煮沸2min，將培養基冷卻至45℃～50℃傾注平板。使用前臨時製備，不得超過3h。（四）磷酸鹽緩衝液1.成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）340g蒸餾水500mLpH722.製法貯存液：稱取340g的磷酸二氫鉀溶於500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH，用蒸餾水稀釋至1000mL後貯存於冰箱。稀釋液：取貯存液125mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝於適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。（五）無菌生理鹽水1.成分氯化鈉85g蒸餾水1000mL2.製法稱取85g氯化鈉溶於1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。（六）1mol/LNaOH1.成分NaOH400g蒸餾水1000mL2.製法稱取40g氫氧化鈉溶於1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。（五）1mol/LHCl1.成分HCl90mL蒸餾水1000mL2.製法移取濃鹽酸90mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，121℃高壓滅菌15min。附錄B（規範性附錄）大腸菌群最可能數（MPN）檢索表（一）大腸菌群最可能數（MPN）檢索表每g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數（MPN）的檢索見表B.1。表B.1大腸菌群最可能數（MPN）檢索表陽性管數0100010001MPN95%可信限陽性管數下限上限0100010001MPN95%可信限下限上限000