1965年4月1日，格瓦拉給卡斯特羅寫了告別信，辭去黨內外的一切職務、軍籍和軍銜。為了避免連累古巴，他還宣布放棄古巴國籍。他對單一的蘇聯模式感到不解和失望，對社會主義的前途感到憂慮，因為他發現不少的革命者都是在豪華的汽車裏、在漂亮的女秘書的懷抱裏喪失了往日的銳氣。所以，為保持革命者的完美形象，他隻能選擇戰鬥，選擇一個鳳凰涅架式的壯美結局。
1965年6月，格瓦拉率領一支有125人的古巴遊擊小分隊，開赴非洲的剛果（現在的紮伊爾）金沙薩地區，化名“塔圖司令員”，指揮那裏的起義軍，想在非洲的心髒地帶建立一個“新古巴”。然而，格瓦拉領導的起義軍屢遭挫折，格瓦拉認為這裏不適宜建立遊擊中心，便撤回了古巴遊擊隊。格瓦拉決定在玻利維亞的尼阿卡瓦蘇建立遊擊中心。1967年3月22日，以拉蒙為化名的切·格瓦拉領導遊擊隊開始軍事行動。
1967年8月，由於叛徒的告密，遊擊隊的秘密倉庫被搗毀，城市中的聯絡網也遭到破壞。8月31日，遊擊隊分兩路突圍。由於華金率領的一路在橫渡馬西庫裏河時，遭到玻政府軍的襲擊，全軍覆沒。格瓦拉率領的17名遊擊隊員被圍於尤羅峽穀。10月8日下午1時，格瓦拉率遊擊隊員滑下峽穀準備突圍。傍晚，格瓦拉腿部不幸中彈。一個遊擊隊員將他由穀底拖到山頂。當他正埋頭包紮傷口時，玻政府軍槍口已對準了他。格瓦拉鎮靜地說了句：“我是切·格瓦拉。”
格瓦拉被俘的消息像閃電一樣迅速傳到了玻利維亞最高當局和美國中央情報局。次日黎明，玻利維亞武裝部隊司令親自乘直升機趕到現場，確認被俘者就是格瓦拉，並對其進行審訊。格瓦拉早已將生死置之度外，拒不回答任何問題。審訊一無所獲。最後，審訊者問：“你現在在想什麼？”格瓦拉堅定地回答：“我在想，革命是永垂不朽的。”1967年10月9日下午，審訊者見從格瓦拉口中得不到任何口供，便將格瓦拉槍殺，時年39歲。
法國哲學家及作家薩特在評價切·格瓦拉時說：“他是我們時代最完美的人。”他被冠以“浪漫的冒險家”、“紅色的羅賓漢”、“共產主義的堂·吉訶德”、“塵世的耶穌”等稱號，在東西方不同的政治、文化背景下久久地傳頌著。直到如今，格瓦拉那憂鬱、深沉的眼睛，綴著小紅星貝雷帽的頭像還廣泛地出現在酒吧的牆壁和青年人的T恤衫上。
切·格瓦拉給父母的告別信親愛的老人家：
又一次，我似乎覺得．我的雙腳又碰觸到這匹贏馬的肋骨；又一次，我似乎覺得．我手挽戰盾，上路前行。
距今將近十年之前，我曾寫過另一封信，向你們倆告別。我記得，在那封信中，我悲歎自己既當不成好戰士，又當不成好醫生。現在．我對當醫生已沒有興趣了，但我卻不是一個蹩腳的戰士。
本質上我並沒有什麼改變，除了我比前更加清楚，我的馬克思主義已經根深蒂固，更加純淨——我是一個冒險家，隻不過是另一種形式的——我是這種冒險家中的一個，為了證明他們平凡的道理。他們甘冒風險。
很可能．這次將是我生命的結束。我並不想尋死，但死總是大有可能，總是合乎邏輯的。如果我這一次死了，讓我最後一次擁抱你們倆吧。
我一直深深地愛著你們，隻是我不知如何表達我的愛。我為人非常固執嚴格，我想有時你們並不了解我。想了解我是不容易的。不過，請你們今天就姑且信我的話吧。
現在，我用藝術家的趣味磨煉的意誌．將支撐我搖晃的雙腿和疲乏的肺腑。我願意這樣幹下去。
請時時想念我這個20世紀渺小的征人吧。讓我吻茜麗亞、羅伯托、約翰·馬丁與普托亭、貝德裏茲，以及所有的人吧。
讓你們頑固的、狂放不羈的兒子再擁抱你們一次吧。
（此信寫於1965年夏秋之間）