④ 配製膠條平衡緩衝液Ⅱ。
⑤ 第一次平衡結束後，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液Ⅰ。並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白質或損壞凝膠表麵）。再加入膠條平衡緩衝液Ⅱ，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15min。用濾紙吸去聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多餘的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌麵上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。將瓊脂糖封膠液進行加熱熔解。將10×電泳緩衝液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩衝液。趕去緩衝液表麵的氣泡。
⑥ 第二次平衡結束後，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液Ⅱ。並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白質或損壞凝膠表麵）。將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠麵完全浸沒在1×電泳緩衝液中。然後將膠條膠麵朝上放在凝膠的長玻璃板上。其餘膠條同樣操作。將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一麵對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠麵完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背麵的支撐膜，不要碰到膠麵。
⑦ 放置5min，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固後,將凝膠轉移至電泳槽中。
⑧ 在電泳槽加入電泳緩衝液後，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線後，再加大電流（或電壓）（20～30mA/gel/17cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。電泳結束後，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，並切角以作記號（戴手套，防止汙染膠麵）。
⑨ 進行染色。
3.凝膠圖像掃描與分析
將電泳膠在20%三氯乙酸中固定1h，蒸餾水衝洗，用考馬斯亮藍染液染色。使用10%乙酸脫色，並用圖像掃描儀收集膠圖，用Image Master 2D Evolution軟件對所得的圖像找點、背景削減和匹配。
4.蛋白質鑒定
切膠儀切取蛋白質點，經脫色、幹燥後加入20μg/L胰酶，37℃作用2h。以50%乙腈-0.5%三氟乙酸溶解肽段及等體積飽和CCA（2-氰基-4-羥基肉桂酸）與之混勻，點靶儀點樣。MALDI-TOF MS進行蛋白質肽質量指紋圖譜分析，並進行蛋白質數據庫檢索。
三、應用
雙向電泳不僅能同時測定蛋白質的等電點、分子質量，更重要的是它還可用於了解蛋白質混合物的組成及變化，如不同細胞、亞細胞中的蛋白質組成及含量差異，從而在臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開發、食品檢測、甚至物種鑒定等研究中做出了重大貢獻。
例如，張磊等利用二維電泳圖譜研究PC12細胞蛋白質組學，用Image Master 2D Evolution軟件對所獲的圖譜進行分析，共得蛋白點(879±24)個。在等電點4～7、相對分子質量20000～66000的區域，蛋白點豐富；而在酸性端和堿性端，蛋白點少。PC12細胞的二維電泳圖譜。
從電泳膠上切取配對良好、散在分布的蛋白質點45個,進行質譜鑒定,得到可信鑒定結果19個,具體膠上分布。蛋白質的具體結果,包括蛋白質的NCBI檢索號碼、理論等電點及相對分子質量,其中等電點及相對分子質量是根據肽質量得到蛋白質的理論值。數字相互對應。另外,在膠上可見到兩個蛋白點均鑒定為19號蛋白,即熱源蛋白27,這可能是由於翻譯後修飾所致。19號蛋白點(熱源蛋白27)的具有代表性的肽質量指紋質譜圖,其中X軸為質核比(m/z),Y軸為相對豐度。
所鑒定出的19個蛋白質功能多樣,這些蛋白質從功能上分成以下幾類:分子伴侶及相關功能蛋白、細胞結構/骨架蛋白、代謝相關蛋白、凋亡相關蛋白、激素結合相關蛋白、神經內分泌相關蛋白，這些蛋白質建立了PC12細胞的部分蛋白質數據庫。從膠圖上可以看出,豐度最大的點主要集中在分子伴侶及相關功能蛋白和細胞結構/骨架蛋白上,體現了這兩類蛋白質在細胞內的功能重要性。
同時這些蛋白在膠上散在分布,為以PC12細胞為對象的蛋白質組學研究確立了標誌蛋白。