雙向電泳全稱為PAGE雙向電泳，是一種由任意兩個單向PAGE組合而成的、在第一向電泳後繼而在其垂直方向進行第二向電泳的分離方法。1975年O′Farrall等人根據不同組分之間的等電點差異和分子質量差異建立了IEF/SDS-PAGE雙向電泳。IEF/SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質（包括核糖體蛋白、組蛋白等）的分離是極為精細的，因此特別適合於分離細菌或細胞中複雜的蛋白質組分。“蛋白質組”即指某一生物係統中的所有蛋白質組分。通過蛋白組學分析，可以在蛋白質水平上對不同蛋白進行定性和定量分析，從而比較不同的蛋白質組。細胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質，有些報道可以分辨出5000～10000個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質數量接近。由於二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白質。例如將某個蛋白質的mRNA轉入到青蛙的卵母細胞中，通過對轉入和未轉入細胞提取液的二維電泳圖譜的比較，轉入mRNA的細胞提取液的二維電泳圖譜中應存在一個特殊的蛋白質斑點，這樣就可以直接檢測mRNA的翻譯結果。
一、基本原理
IEF/SDS-PAGE雙向電泳中通常第一維電泳是IEF，在細管（1～3mm）中加入含有兩性電解質、8mol/L的尿素以及非離子型去垢劑的聚丙烯酰胺凝膠進行IEF，變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離。在第二維的電泳過程中，結合SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據分子質量大小被分離。這樣各個蛋白質根據等電點和分子質量的不同而被分離。
樣品製備是雙向電泳過程中的第一步，也是重要的一步。理想情況下，要進行研究的生物樣品中的所有蛋白質都應是已溶解的，否則由於樣品在緩衝液中緩慢溶解，而可能出現明顯的條紋。
二、基本操作
下麵以分離PC12細胞蛋白質組分為例，詳述其操作過程。
（一）溶液配製
（二）操作步驟
1.第一向IEF（用自製的水化上樣緩衝液，17cm的膠條，pH4～7）
① 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩衝液（Ⅰ）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1mL/管），置室溫溶解。
② 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4～6、5～7各2.5μL，充分混勻。
③ 從小管中取出400μL水化上樣緩衝液，加入100μL樣品，充分混勻。
④ 從冰箱取-20℃冷凍保存的IPG預製膠條（17cm pH4～7），於室溫放置10min。
⑤ 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。
⑥ 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中後，用鑷子輕輕的去除預製IPG膠條上的保護層。
⑦ 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠麵朝下置於聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應於聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背麵的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下麵的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。
⑧ 在每根膠條上覆蓋2～3mL礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
⑨ 對好正、負極，蓋上蓋子。設置IEF程序。
⑩ 聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置於樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。
2.第二向SDS-PAGE電泳
① 配製10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80mL凝膠溶液，每塊凝膠40mL，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封麵，保持膠麵平整。聚合30min。一般凝膠與上方液體分層後，表明凝膠已基本聚合。待凝膠凝固後，倒去分離膠表麵的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水衝洗。
② 從-20℃冰箱中取出的膠條，先於室溫放置10min，使其溶解。
③ 配製膠條平衡緩衝液Ⅰ。在桌上先放置幹的厚濾紙，聚焦好的膠條膠麵朝上放在幹的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多餘水分，然後直接置於膠條上，輕輕吸幹膠條上的礦物油及多餘樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。將膠條轉移至溶脹盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5mL膠條平衡緩衝液Ⅰ。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15min。