等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是20世紀60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離不同等電點的蛋白質的電泳技術。在IEF中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。由於其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合於分離分子質量相近而等電點不同的蛋白質組分,但是對於在等電點時發生沉澱或變性的樣品卻不適用。
一、基本原理
IEF的關鍵是在凝膠中形成穩定的、連續的線性pH梯度。根據建立的pH梯度原理的不同，可分為載體兩性電解質pH梯度的IEF和固相pH梯度的IEF。前者是將載體兩性電解質溶解在電泳介質溶液中製膠，形成聚丙烯酰胺或瓊脂凝膠，然後將凝膠引入電場中進行IEF。後者是將弱酸、弱堿兩性基團直接引入丙烯酰胺中，在凝膠聚合時形成pH梯度，因此其pH梯度固定，不隨環境電場等條件變化。
以載體兩性電解質pH梯度的IEF為例，在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH逐漸增大。蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等於聚焦蛋白質分子的等電點（pI）。同理，位於酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間後，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。
pH梯度的組成方式有兩種，一種是人工pH梯度，由於其不穩定，重複性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一係列兩性電解質的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入堿液，如NaOH、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0示。
電泳開始後，混合物中pH最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液界麵時，pH突然下降，甚至接近或稍低於pI1，這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由於兩性電解質具有一定的緩衝能力，使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點範圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由於pI2＞pI1，因此定位於第一種兩性電解質之後，這樣，經過一定時間後，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度。
二、基本操作
1.IEF電泳凝膠的製備
蒸餾水2.62mL、IEF瓊脂糖0.06g和山梨醇0.76g在沸水浴中加熱約20min至完全溶解，如有殘留顆粒會影響電泳效果。迅速加入尿素1.9g、硫脲0.48g至全溶，輕輕攪拌均勻，然後迅速加入兩性電解質（pH3.5～10）(477μL)混勻，放置數分鍾消泡，注意防止固化。混合液用注射器加入電泳管中，至內標線為止，在灌製過程中膠管頭應始終保持在液麵下，不能產生氣泡。在液麵上加入50μL重層液，注意不能擾亂界麵。5～10℃，放置4h到一夜固化備用。固化後於5～10℃可保存5個月，凝膠幹後不能再用。