在聚丙烯酰胺凝膠中加入適量的SDS或尿素,或SDS-尿素後,用其作支持物進行的凝膠電泳稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。此電泳可用於單鏈DNA、寡核苷酸片段以及蛋白質亞基、膜蛋白、肽類等物質的分析,還可用於研究大分子物質的折疊結構等方麵。實驗中一般取已知分子質量的蛋白質作“標準蛋白”(marker)與被測樣品在同一條件下進行電泳,就可測出被測樣品的分子質量。若同時加入還原劑如β-巰基乙醇,可使蛋白質分子內的二硫鍵被打開,這樣分離出的譜帶即為蛋白質亞基,從而可以分析蛋白質的二硫鍵情況。
一、基本原理
由於SDS帶有大量的負電荷,消除了蛋白質分子之間原有電荷的差異。所以,蛋白質的遷移率僅取決於蛋白質的分子質量的大小。與已知分子質量的標準品比較,可以測定蛋白質的分子質量。
SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離範圍,取決於用於灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯度。在沒有交聯劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的黏稠溶液,而經雙丙烯酰胺交聯後凝膠的剛性和抗張強度都有所增加,並形成SDS-蛋白質複合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺/丙烯酰胺”比率的增加而變小,比率接近1∶20時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺/丙烯酰胺”為1∶29配製,實驗表明它能分離大小相差隻有3%的蛋白質。
凝膠的篩分特性取決於它的孔徑,而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數。用5%~15%的丙烯酰胺所灌製凝膠的線性分離範圍。
二、基本操作
SDS-PAGE操作與上述PAGE的操作大體相似,其不同之處有:
1.電泳前的樣品處理
,配製一定量的二倍樣品緩衝液,在4℃條件下可儲存數月。每次使用前,樣品與樣品緩衝液以1∶1進行混合,煮沸5min,離心,作為點樣用。
2.電泳溶液的配方
SDS-PAGE電泳溶液的配方,分離膠溶液和濃縮膠溶液配方分別,其他同常規PAGE。
三、應用
應用SDS-PAGE可測定蛋白質的分子質量,對蛋白質組分進行分離、分析、純化、定性、定量以及少量的製備。相對於超離心、色譜、滲透法等,SDS-PAGE是測定蛋白質亞基分子質量的一種簡單、經濟、快捷的方法。
(一)蛋白質組分的分離
采用SDS-PAGE法對豬皮酶水解膠原蛋白產物進行分離,可以對樣品進行較好的分離,得到較清晰的分離圖譜。其實驗條件為:采用Tris-甘氨酸電極緩衝液體係,考馬斯亮藍加甲醇-冰乙酸的染色液和甲醇-冰乙酸脫色液體係,分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為4%的不連續凝膠係統,樣品濃度為0.1g/mL,上樣量為4~10μL。
(二)蛋白質組分分析
唐曉琳等通過SDS-PAGE法分析成人牙周炎患者唾液蛋白成分,並對牙周基礎治療前後唾液蛋白成分的改變進行觀察,以期初步篩選與牙周炎相關的蛋白因子。對牙周炎與正常對照組全唾液電泳進行分析。
(三)鑒定蛋白質純度
邵彪等從黑豆中分離純化出抗真菌蛋白,經SDS-PAGE鑒定已達到電泳純。圖中DTT是SDS-PAGE電泳樣品的還原處理液。DTT-和DTT+均表現為單一條帶,可以判斷這個抗菌蛋白為單鏈蛋白,並且在其分子內不存在由2個半胱氨酸形成二硫鍵的結構。