以澱粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質的區帶電泳法稱為凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳方法，人為控製聚丙烯酰胺凝膠聚合成孔徑的大小，通過類似分子篩的作用把蛋白質分開。可用於蛋白質、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及製備，並可測定其相對分子質量和等電點，研究蛋白質的構象變化等。聚丙烯酰胺凝膠可用於常規及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳、聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳及蛋白質印跡等。
一、基本原理
聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(N,N′-methylenebisacrylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。
（一）聚丙烯酰胺凝膠的合成
1.凝膠總濃度與凝膠特性
凝膠溶液中單體和交聯劑的總濃度和兩者的比例是決定聚丙烯酰胺凝膠特性，包括其機械性能、彈性、透明度、黏著度及孔徑大小的主要參數。通常凝膠的篩孔孔徑、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的，而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加。1962年Hjertén S引入兩個計算公式，即凝膠總濃度（T）是表示凝膠溶液中單體和交聯劑的總百分含量。
ma與mb的比值對凝膠的篩孔孔徑、透明度和機械強度等性質也有明顯的影響。當ma∶mb小於10時，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色；當ma∶mb大於100時，即使使用5%的丙烯酰胺凝膠，也呈糊狀，且易斷裂；通常用ma∶mb在30左右，並且丙烯酰胺濃度高於3%，凝膠富有彈性並且透明。
2.凝膠孔徑大小與濃度和交聯度的關係
聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決於凝膠的總濃度T和交聯度C。有效孔徑隨著T的增加而減小，電泳中帶電顆粒移動時受到網孔的阻力增大。當凝膠總濃度小於2.5%時，可以篩分相對分子質量為106以上的大分子，但此時凝膠幾乎是液體，通常要加0.5%的瓊脂糖來增加凝膠的硬度而不影響凝膠的孔徑大小；當凝膠濃度大於30%時，則可以篩分分子質量小於2ku的多肽,在凝膠總濃度一定時，交聯劑（Bis）含量不同影響凝膠的孔徑，交聯劑的含量與不同凝膠濃度平均孔徑之間的關係。
凝膠孔徑大小有一定範圍，每次製備凝膠時所得到的有效孔徑不完全相同。
3.凝膠總濃度與凝膠的分子篩效應
凝膠的三維網狀結構具有分子篩效應，在凝膠中生物大分子的分離取決於它的淨電荷和分子大小。分子篩效應的大小取決於凝膠孔徑大小與生物大分子大小相接近的程度。凝膠濃度不同，平均孔徑也不同，不同大小和形狀的大分子通過孔徑時所受的阻滯力也不同，加上大分子的電荷效應，通過各種大分子遷移率不同得以分離。在實際工作中，常依據待分離蛋白質已知相對分子質量的大小來選擇合適的凝膠濃度，使蛋白質混合物得到最大限度的分離，得到良好分離效果時，蛋白質和核酸相對分子質量與凝膠濃度的關係。大多數蛋白質在7.5%凝膠中能得到滿意的分離結果，所以這個濃度的凝膠稱為標準膠。當分析一個未知樣品時，常用標準膠或梯度凝膠來測試，而後確定適宜的凝膠濃度。
4.聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式
聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過氧遊離基(free radicals)提供的催化作用，使體係發生氧化還原作用來完成的。催化體係主要有化學催化和光化學催化體係。
（1）化學催化係統丙烯酰胺的化學催化聚合過程是在引發劑和加速劑組成的係統中完成的。參與反應的引發劑有過硫酸銨（APS）或過硫酸鉀、過氧化氫等，而參與反應的加速劑則有二甲胺丙腈和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）等。由於丙烯酰胺聚合時，可在酸性或堿性條件下進行，所以選用的引發劑和加速劑就應隨著堿性變化而變化。
APS-TEMED催化體係屬於化學聚合作用體係，TEMED是一種脂肪族叔胺，它的堿基可催化溶液中的AP使其形成硫酸根自由基，S2O82-→2SO4·-，激活Acr形成單體長鏈。
含有這種多聚體鏈的溶液盡管比較黏稠，但不能形成凝膠。隻有在交聯劑Bis的作用下長鏈彼此交聯聚合成凝膠。
聚合反應受各種因素的影響，如係統中催化劑和加速劑的濃度、pH、溫度、分子氧和雜質含量都會影響凝膠的聚合過程。一般在室溫下比在0℃時聚合快，溶液預先抽氣的比不抽氣的聚合快。
（2）光催化係統核黃素-TEMED催化係統屬於光聚合作用係統，聚合原理是核黃素在光照條件下分解，被還原成無色核黃素，後者在有少量氧的條件下，被氧化形成自由基，從而引發聚合反應。通常將混合液置於一般熒光燈旁，即可使反應發生。用核黃素聚合時，可不加TEMED，但是其加入後可以加速聚合。用這種催化劑的優點是，用量極少，對分析樣品無任何不良影響；聚合時間可以通過改變光照時間和強度來延長或縮短。
光聚合反應受許多因素的影響：大氣氧可以淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表麵覆蓋一層水或溶液隔絕空氣，可加速聚合；低溫、低pH都會減慢聚合反應速度；有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃及一些金屬等可抑製聚合反應。
（二）分離效應
用凝膠電泳分離蛋白質樣品時，在不連續PAGE中有三大物理效應，即濃縮效應（發生於濃縮膠中）、電荷效應和分子篩效應（發生於分離膠中）。
1.濃縮效應
凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩衝液pH6.7，分離膠為小孔膠，緩衝液pH8.9。在上下電泳槽內充以Tris-甘氨酸緩衝液(pH8.3)，這樣便形成了凝膠孔徑和緩衝液pH的不連續性。
在濃縮膠中HCl幾乎全部解離為Cl-，但隻有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。蛋白質的等電點一般在pH5左右，在此條件下其解離度在HCl和甘氨酸之間。當電泳係統通電後，這3種離子都向陽極移動。其有效泳動率依次為Cl-＞蛋白質＞H2NCH2COO-，故Cl-稱為快離子，而H2NCH2COO-稱為慢離子。電泳開始後，由於快離子的泳動速率最大，就會很快超過被分離物，因此在快離子後麵，形成一個離子濃度低的區域，這時就有了較高的電位梯度。這種高電位梯度使後麵被分離物和慢離子在快離子後麵加快移動。當快離子、被分離物和慢離子的泳動速率相同時，建立一種穩定狀態，這時在快離子和慢離子之間形成一個穩定而又不斷向正極移動的界麵。由於蛋白質的有效泳動率恰好介於快慢離子之間，因此蛋白質離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成一條狹窄的中間層，這種濃縮效應可使蛋白質濃縮數百倍。