2.電荷效應
樣品進入分離膠後，慢離子甘氨酸全部解離為負離子，泳動速率加快，很快超過蛋白質，高電壓梯度隨即消失。此時蛋白質在均一的外加電場下泳動，但由於蛋白質分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質的泳動速率不同而形成一條條區帶。所以各種蛋白質樣品經分離膠電泳後，若樣品組分的分子質量相等，則它們就以圓盤狀或帶狀按電荷順序一個一個地排列起來。但SDS-PAGE中，各種SDS-蛋白質複合物在電泳中不同的泳動率與蛋白質所帶電荷無關，因為SDS這種陰離子表麵活性劑可以降低或消除蛋白質天然電荷差別。
3.分子篩效應
分子質量或分子大小和形狀不同的被分離物通過一定孔徑分離膠時，受阻塞的程度不同而表現出不同的遷移率，這就是分子篩效應。經過濃縮效應後，前導離子（快離子）、被分離物和尾隨離子（慢離子）均進入分離膠中，這時膠的pH不同，使得前導離子與尾隨離子的遷移率相同，不再形成高電位梯度，所有物質在同一、均一電壓梯度下遷移。這時分子質量大小和形狀與其遷移率密切相關，分子質量小並且為球形的移動快。
二、基本操作
PAGE的種類繁多，如圓盤電泳、不連續垂直板狀電泳和水平平板電泳。但就其操作而言，卻是大同小異。此處主要討論不連續垂直板狀凝膠電泳的操作。
（一）不連續垂直板狀凝膠電泳裝置
不連續垂直板狀凝膠電泳裝置通常由穩流電泳儀和平板電泳槽組成。
常見的一種電泳槽是垂直夾心板狀。電泳槽一般包括上、下各一個緩衝液槽。上麵的緩衝液槽用於盛緩衝液和電泳時支撐凝膠板。下麵的緩衝液槽除了盛緩衝液外，還用於支撐上麵的緩衝液槽和冷卻係統。電極由鉑金絲製成，在安全蓋上有兩個接頭與電源相連。根據可以同時電泳凝膠的數目分為單板和雙板電泳槽。它的膠板模則是由兩塊正方形或長方形、大小適中、性質均一的玻璃板，數種不同厚度的U形軟矽橡膠槽和一個“梳子”組成。
電泳儀是一種恒壓恒流的電源裝置，其量程通常為600V、100mA。
（二）電泳步驟
1.安裝玻璃板
將兩塊幹淨的凝膠板中間用膠條密封，用電泳夾將凝膠板夾好，保持良好的密封性，可用石英水檢測有無泄漏。
2.製備分離膠
配製各種儲液，置冰箱保存備用。根據分離樣品的性質選擇一定的凝膠濃度，配製分離膠溶液。把配好所需濃度的分離凝膠溶液，用接種針將其引流入兩玻璃板之間至板頂1cm多處停止灌膠，然後加入適量無水乙醇或重蒸水，使其接口平齊，同時也可使其與空氣隔絕，以利聚合。一般情況下，置室溫0.5h左右即可以聚合，再過0.5h即聚合完全。
3.預電泳
傾去聚合好的凝膠板上端的無水乙醇，插入電泳裝置中，以製備分離膠的緩衝液作為電極液，電泳0.5～2.0h，電壓180V，此過程為預電泳。預電泳的目的在於除去分離膠聚合後殘留的APS，以免它使某些樣品（如蛋白酶等）失活或產生以外的影響；另外，為確保電泳參數的恒定，還應除去未聚合的丙烯酸以及能吸收紫外光的雜質。
預電泳不能在加濃縮膠後進行，也不能在電極緩衝液中進行。否則會破壞電泳的不連續係統。如在電極緩衝液和樣品液中加入1%～5%的β-巰基乙醇或β-DTT，則不進行預電泳也可消除殘留APS的氧化作用。預電泳後，可直接加濃縮膠，或者在含有少量重蒸水的分離膠頂端加液體石蠟封閉，置4℃可儲存數天。使用時，需將分離膠頂部的溶液吸去。
4.濃縮膠的製備
用滴管小心地吸去已配好分離膠的上層重蒸水，再用濾紙條吸幹，而後加濃縮膠。加濃縮膠到接近凝膠板頂端時，插入與凝膠厚度一樣的“梳子”。濃縮膠的製備如用核黃素作催化劑聚合時，應在膠板上方10cm處掛一根日光燈管，照射6～7min後，凝膠變為乳白色，表明聚合開始，再照射0.5h，則聚合完全，然後拔出梳子，於是在聚丙烯酰胺膠中便鑄就若幹個樣品的凹穴。
5.加樣
將用濃縮膠緩衝液溶解的樣品（1mg/mL）10～200μL與過量的穩定電流介質溶液（體積分數為30%的蔗糖或甘油與0.01%指示劑配製的水溶液）混勻後，用微量注射器按順序從凝膠板頂部加樣，每個凝膠孔加樣品15～20μL，稀溶液最多可加150～200μL。加樣時，微量注射器的針頭伸入凝膠孔的內部，但針頭不要碰到膠麵，緩緩加入，因樣品相對密度較大，因此樣品液自動沉降在膠麵上平鋪成一層。
6.電泳
濃縮膠一旦製備完畢，就不宜儲存了，而應立即進行電泳。加樣前，先把凝膠板旁邊的密封膠條除去，請勿將凝膠板拉壞或產生氣泡。將電解液注入電泳槽中，將固定在架子上的凝膠板按正負極接通電源，打開電泳儀（仔細觀察正負極的變化）。一般是樣品進分離膠前電流控製在15～20mA，15～20min；樣品進入凝膠以後，再將電流調至40～50mA，保持電流強度不變。待指示染料遷移至下沿約0.5cm處關閉電源，停止電泳，取出凝膠板。用過的電極緩衝液（因pH發生了變化，故要把正負極溶液混勻），可重新使用1～2次。
7.剝膠和固定
將凝膠板放入裝滿水的染色槽內，用注射器裝滿水，其針頭沿板壁內側插入，邊前進，邊注水；將短板玻璃撬開，再用水緩慢衝擊凝膠，直到凝膠從玻璃板上脫離。取膠時切忌損傷膠麵，否則影響掃描效果。把取出的凝膠浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸水溶液中幾分鍾到幾小時，以固定其中含有的蛋白質組分。有時也可把凝膠直接浸泡在染色液中，使固定和染色同時進行。
8.染色及脫色
用染料和生物大分子結合形成有色的複合物是電泳後檢測最常用的方法。選擇高吸光係數的染料，與生物大分子緊密結合，形成有色不溶的複合物，而支持介質不吸附染料，便於背景的脫色，有利於蛋白質條帶的辨別和定量掃描，從而檢測出蛋白質的純度、含量及生物活性。可用於蛋白質電泳條帶的染色方法很多，常用的主要有以下3種：
（1）氨基黑、考馬斯亮藍以及銀試劑檢測蛋白質染色最早是用氨基黑類染料，這是一類含有磺酸基的酸性染料，它通過磺酸基與蛋白質的堿性基團形成複合鹽。常用的有：氨基黑10B(amino black 10B)、萘黑12B 200(naphthalene black 12B 200)、萘酚藍黑6B(naphthol 6B)、水牛黑(buffalo black)等。這類染料對不同的蛋白質著色不同，有藍色、棕色、黑色，借此可以鑒別不同類型的蛋白質。這類染料對不同的蛋白質結合量不同，染色不均一和深背景會影響蛋白質的定量。但其因染色靈敏度較低，已很少應用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍所代替。