2.樣品處理
用1mL樣品處理液溶解10mgDTT，按樣品體積的10倍加入樣品處理液，4℃，10000r/min離心5min。
3.聚焦
去除IEF管裏的重層液，加入樣品，上樣上限為50μL；沿管壁加入10μL重層液，再加入100μL上部電極液至管口，加時要慢不能擾亂界麵，整個管內不能有氣泡，否則影響電泳效果；在下部槽中加入500～550mL下部電極液，上部槽中加入40mL上部電極液開始等電聚焦，泳動電壓300V，泳動時間150min。
4.固定和染色
電泳後，不可用染色劑直接染色，因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合，因此應先將凝膠浸泡在5%的三氯乙酸中去除兩性電解質，然後再以適當的方法染色。測量蛋白帶到酸端的距離，以及膠條的總長度。
5.等電聚焦標準曲線
預留一根製備好的膠不加樣品，其他步驟與加樣品的膠操作相同，同時進行等電聚焦。聚焦完畢，膠柱兩端和玻璃管外壁用蒸餾水洗滌三次，以免汙染電極液而影響真實pH，從玻璃管中取出膠柱，用刀片以0.5cm的長度分段切下，按次序分別浸入4mL、0.01mol/L的KCl中，4℃過夜。置室溫平衡後，測出各段的pH。以各段膠所在的位置與膠條長度的比值為橫坐標，以相應的浸泡液pH為縱坐標做圖，可得膠柱的pH梯度曲線。
6.等電點的測定
根據加樣膠柱上的染色位置與膠條總長的比值，與標準曲線圖相比，即可測出蛋白質的等電點。
三、應用
利用IEF技術，可對蛋白質組分進行分離、分析、純化、定性、定量以及製備，最廣泛應用於測定蛋白質的等電點。
用標準蛋白質的等電點（作為縱坐標）對其在IEF中移動的距離（作為橫坐標）作圖，即可得到標準的等電點曲線圖。當測定未知蛋白質的等電點時，隻要在同樣的IEF條件下求出其移動距離，就可以從等電點曲線圖中查出相應的等電點。
這種方法測定等電點的不足之處是，有些蛋白質會與兩性電解質載體發生可逆性結合，形成虛假的多重譜帶，故應用此方法鑒定蛋白質純度時必須注意。在等電聚焦時，改變加樣部位，或改變凝膠中兩性電解質的濃度，電泳圖譜不會發生改變。另外，等電聚焦形成的單一譜帶再進行等電聚焦，其仍為單一譜帶時，則表明兩性電解質載體和待測樣品組分並不相互作用。