3.熒光光度法和可見光光度法
利用UK的酞胺解活性，催化酞胺水解為羧酸和胺，而後者具有熒光和/或吸收可見光的性質，其熒光值或吸光度在一定範圍內與UK活力成正比，從而可快捷地測量UK的活力。如顯色底物S-2444在UK的催化下發生以下反應:
L-Gly-L-Arg-p-nitroanilideUKL-Gly-L-Arg+p-nitroanilide
對硝基苯胺在405nm處有特征吸收峰，因此可以靈敏地測定UK的活力。這兩種方法操作方便，缺點在於熒光試劑和顯色劑價格昂貴。
二、激肽釋放酶的純化
（一）激肽釋放酶性質
激肽釋放酶(kallik rein，簡稱KLK)，屬絲氨酸蛋白酶的一種，存在於各種組織和生物液體中。KLK可催化大分子前體物(激肽原，kininogen)釋放生物活性肽(激肽，kinin)，也稱之為激肽原酶(kinino-genases)。目前，KLK主要分為兩大類，即血漿激肽釋放酶(PK)和組織激肽釋放酶(TK)，兩者在其分子質量、底物特異性、免疫生物學特性、基因結構以及所釋放的激肽類型等方麵均存在明顯差異。KLK作為一種蛋白酶，不僅可催化前體物釋放生物活性肽，且組成其家族的各個成員在基因和蛋白質結構中都具有高度的功能保守性和序列同源性，具有相同的染色體定位。其中TK是一個大的多基因家族，由15個成員組成，各成員間基因序列、蛋白水平、三級結構極為相似。“人激肽釋放酶”泛指“TK”。
（二）激肽釋放酶結構
人KLK基因長4～10kb，其差異大多在於內含子的長度不同。常見結構特征有：① 外顯子的長度或相近或相等。所有基因在DNA和氨基酸水平上具有高度同源性(40%～80%)；② 各基因中均含有催化三聯體殘基(組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸殘基)的絲氨酸蛋白酶。通常情況下，組氨酸位於第2個外顯子近末端。天冬氨酸位於第3個編碼外顯子的中間。絲氨酸殘基位於第5個外顯子起始處；③ 所有KLK蛋白均以前肽的形式合成，在N末端帶有一個長17～20個氨基酸的信號肽，其後緊接4～9個氨基酸的活性肽，再連接有酶促活力的成熟蛋白；④ 底物結合位點氨基酸通常是天冬氨酸(指示11種類胰蛋白酶特異性)或其他活性氨基酸；⑤ 大多數基因受類固醇激素的調節；⑥ 均含有10～12個半胱氨酸殘基，即可形成5～6個二硫鍵。
（三）激肽釋放酶粗分離
豬胰髒中KLK含量較高，來源豐富。工業化生產中通常以豬胰髒為原料製備KLK，粗分離流程一般為：將豬胰髒絞碎，加緩衝液提取，過夜攪拌活化，壓濾，丙酮沉澱，脫脂脫水幹燥，得KLK粗酶。通過提取緩衝液中添加Ca2+激活KLK，可縮短操作時間，提高KLK提取效果。KLK粗分離流程。
采用加入活化劑2.5%CaCl2的HCl溶液用於粗酶製品的提取，是由於Ca2+對胰酶有激活作用，並且能保護胰酶的活力，這樣可使胰酶粗品的收率提高3%。同時，丙酮對沉澱該酶有較好的專一性，使與酶共同沉澱的雜質較少，因而當粗品溶於乙酸緩衝液後，過濾時濾速較快，濾液清亮，克服了濾液渾濁、濾速慢的問題。
（四）激肽釋放酶的細分離
在KLK的細分離時，一般以來源比較廣泛的豬胰髒為原料提取純化TK，主要分離純化方法有有機溶劑或鹽分級沉澱、凝膠過濾、離子交換、親和色譜等。
1.離子交換
離子交換以其操作簡單、快捷、費用低、純化效果好等特點，已經成為蛋白質純化技術中應用最為廣泛的一種方法。對於KLK的分離純化，各種類型的離子交換色譜也被廣泛應用。
例如，用Amberlite IRA-938強堿性大孔徑陰離子交換樹脂分離豬胰酶粗品中的KLK，得到的純化樣品比活達到了112U/（mg蛋白質），得率為79.5%，純化倍數為23.1倍。在實驗過程中流動相的流速可以達到200～250mL/h，這樣就大大減少了操作時間。
用DEAE-纖維素陰離子交換樹脂，並采用攪拌吸附的方法。洗脫液用有機溶劑丙酮以及乙醚沉澱，幹燥得到純化樣品。得到的純化樣品比活為680kU/(mg蛋白質)，活力回收達到80%，純化倍數在200倍以上。
用弱酸性陽離子交換樹脂Amberlite CG50樹脂代替DEAE-纖維素，由攪拌吸附改為柱層析，來純化激肽釋放酶。層析時的流速控製為20～30mL/min，層析結果純化樣品酶比活可以達到107.4U/mg蛋白質。
2.親和層析
與KLK具有較好親和性的蛋白質配基比較多，例如抑肽酶、亮抑肽酶（亮抑製素）、對-氨基苯甲脒等，但抑肽酶和亮抑肽酶存在價格昂貴、穩定性差、難複性等缺點。相比之下，對-氨基苯甲脒作為化學合成物，價格便宜、性質穩定、特異性吸附強，以及吸附量大，相應載體偶聯技術也相對成熟，更適合工業化生產。例如，將激肽釋放酶粗酶經過DEAE-Sepharose 4B離子交換和對-氨基苯甲脒-Sepharose 4B親和層析純化，所得KLK產品比活為300kU/(mg蛋白質)。相對用DEAE-Sepharose 4B離子交換純化倍數為6倍來說，對-氨基苯甲脒-Sepharose 4B親和色譜純化倍數約為45倍。KLK活力回收率為56%～59%。
3.疏水層析
用疏水層析的方法分離提純豬胰KLK時，在層析劑基質與起吸附作用的功能團之間接上一段直鏈碳鏈，它可與蛋白質表麵某一對應疏水區域相互作用，增加對蛋白質的吸附能力，顯著提高蛋白質的分離效果。
操作時選用三種不同的疏水樹脂Octyl Sepharose FF、Phenyl Sepharose FF和Butyl Sepharose FF來進行分離。首先進行鹽析操作，將鹽析後的蛋白質溶解後再加入硫酸銨，就可作為疏水層析的樣品進行疏水層析。三種疏水樹脂的操作結果為Butyl Sepharose FF樹脂的純化效果最好，比活大於500U/mg。此方法不但操作簡單，而且純化效果顯著，是一種可以優先選擇的分離方法。
（五）激肽釋放酶的酶活測定
KLK能水解酯鍵、酰胺鍵和肽鍵，根據這一性質，目前廣泛用於檢測KLK活力的底物主要是N-苯甲酰-L精氨酸乙酯（BAEE）。BAEE在波長253nm下的紫外吸收遠遠弱於N-苯甲酰-L精氨酸（BA）的紫外吸收。在KLK催化水解下，BAEE隨著酯鍵被水解，水解產物BA逐漸增多，反應體係的紫外光吸收值也隨之相應增加，以ΔA253計算KLK的活力。
除了紫外光吸收差值法，免疫熒光檢測也常被使用。由於KLK常用免疫熒光特性檢測，因此可以根據洗脫液中是否有熒光判斷目的蛋白質有沒有被洗脫出，避免了非目標蛋白峰不必要的檢測操作。
三、植物溶菌酶的純化