一、尿激酶的純化
（一）尿激酶的性質尿激酶(Urokinasc,簡稱UK,EC-3.4.21.31)最初從尿中檢出而得名，後來發現它廣泛地存在於哺乳動物和人的尿液、血漿中，此外在惡性增生的前列腺組織和腎細胞培養物中也能發現。
UK是一種糖蛋白，屬絲氨酸蛋白酶類，它的天然蛋白質底物是纖溶酶原，催化纖溶酶原中Arg560-Va1561肽鍵斷裂而形成纖溶酶。UK在人體內半衰期約為15min，50%被腎髒消除，其餘由肝髒分解。部分UK能夠迅速進入血栓內部，激活血栓中的纖溶酶原，轉變為纖溶酶，後者又催化不溶性的纖維蛋白(血凝塊的主要成分之一)降解成可溶性的碎片，從而起到局部溶栓作用；另一部分UK則激活循環體係中的纖溶酶原產生過量的纖溶酶，從而導致循環中的纖維蛋白原、凝血因子V等降解引起全身纖溶亢進而可能導致出血。UK對新鮮血栓溶解迅速、有效，對陳舊性血栓效果相對較弱。此外，UK還有酯解和酞胺解活性，能水解一係列精氨酸或賴氨酸的酯和酞胺。
（二）尿激酶粗品的提取
UK通常是從健康男性新鮮尿液分離或培養的腎組織細胞培養得到，前者因原料易得、價格便宜而被廣泛采用。尿是腎髒生成的排泄物。排泄是指機體把新陳代謝過程中所產生的代謝終產物，以及攝入體內過量的有用物質(如無機鹽類和水)和藥物、異物等，經由血液循環的運輸，從不同的途徑排出體外的生理過程。而由腎髒排泄的物質種類最多，數量最大，而且可以隨著機體的不同情況、攝入物質的不同出汗多少等因素而改變。正常人一晝夜排出的尿量為1～2L。尿液pH為5.0～7.0，相對密度為1.015～1.025。尿中水分為95%～97%，固體物質為3%～5%，後者又可分為有機物和無機鹽兩大類。有機物中主要是尿素，其餘為肌酐、尿酸、尿色素、維生素等;無機鹽主要是NaCl，其餘為硫酸鹽、磷酸鹽和鉀、鐵等鹽類，UK含量為5～7IU/mL。
UK的初步濃縮大致過程如下：收集24h內的健康男性新鮮尿液，向尿液通氣發泡，使泡沫從上口溢出。收集泡液，滴加適量消泡劑，如矽油消泡，可以得到濃縮10倍左右的尿液。用NaOH調節pH至7.5，於低溫靜置除去沉澱雜質，上清液調節pH至6.5。按0.5～1.0g/mL的比例加入矽藻土，攪拌完全後將吸附了UK的矽藻土用蒸餾水衝洗。然後加入4%的氨水解吸，向洗脫物加入固體硫酸銨至60%飽和度，低溫靜置過夜。收集離心分離的沉澱，用蒸餾水溶解，不溶物離心除去，上清液冷凍幹燥，可得黃色粉末狀UK粗酶，活力為100～1000IU/mg。得到的粗酶進一步加工通常采用親和方法，尤其以親和色譜為主。
采用鋅離子從尿中沉澱UK粗品，是沉澱法的一種。取新鮮男性尿6L,分7份,加入ZnCl2使之濃度分別為1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L,調節pH6.5～7.0,攪拌10min,放置1h,移去上清液,過濾沉澱。Zn2+濃度對UK活力和沉澱量的影響,當Zn2+濃度在1～3mmol/L,沉澱酶活力隨Zn2+濃度增加而大幅度增加,3mmol/L時達85%以上,而沉澱的質量為1.5g。在3mmol/L以上,隨著Zn2+濃度增加,沉澱UK總活力趨近極限,而沉澱物的質量的增加仍較明顯,較酶活增加幅度大。這說明在較低濃度時,Zn2+有一定的選擇沉澱UK的作用。控製Zn2+濃度在3mmol/L,可得到85%～92%的UK回收率,而沉澱物的量並不多,便於工藝處理。
硫酸銨溶液的pH對UK溶出的作用。隨著pH遞增,UK溶出效果逐漸增加,在pH10～10.5達到7.84×105IU/L。若繼續增加pH,氨水用量會大幅度上升,UK溶出已不再增加。在pH10～10.5,UK已經接近完全溶出,而氨水用量不大。
20g/L硫酸銨溶解UK沉澱,使硫酸銨達到不同飽和度，鹽析8～10h,傾去上清液,過濾沉澱,用4倍量0.05mol/L Na2HPO4溶解,測定酶活與蛋白質含量。
（三）尿激酶的純化
UK的純化，除了使用傳統的色譜法，還通常采用親和色譜的方法，常用的親和配體包括單克隆抗體、天然抑製劑、合成抑製劑、含有精氨酸的寡肽以及其他含有脒基或胍基的化合物。幾種色譜方法結合才能更完全的純化UK。下麵以分離高分子質量和低分子質量UK來闡述UK的純化方案。
稱取1g UK粗品，溶於50mL蒸餾水中，離心除去不溶物，取上清液用起始緩衝液透析，用0.45μm濾膜過濾，苯甲脒柱用起始緩衝液平衡後上樣、平衡，用洗脫緩衝液洗脫並分部收集，2.3mL/管。洗脫曲線。
合並5～13管的組分(約20mL)，用Sephadex G-25除鹽，上SP（強陽離子交換）柱。SP柱預先用平衡緩衝液平衡，上樣後用平衡液平衡至基線穩定，進行梯度洗脫，收集洗脫峰。中峰1(洗脫體積65～80mL)為LUK，收集峰3(145～176mL)為HUK。SDS-PAGE鑒定結果，HUK和LUK均呈單一條帶，位置分別在54ku和33ku。
采用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，纖維蛋白平板法測定活力得到純品的比活，HUK為2.9×105IU/mg蛋白，LUK為3.5×105IU/mg蛋白。分離純化的結果。
（1）UK的米氏動力學常數測定用Marquardt-Levenberg算法，以對v對[S]作非線性擬合得到以下擬合結果，HUK：Km=63.2μmol／L，Vm=73.2nmol/（L·s）；LUK：Km=49.4μmol／L，Vm=45.8nmol/（L·s）。
（2）UK水解底物S-2444的kcat值測定實驗中測得不同酶濃度下的反應初速度(3次數據平均值)，得到[E]-v數據，由公式Vm=(Km+[S])／[S]，計算可得到[E]-Vm關係，得到的直線斜率即是kcat；HUK的kcat值為15.4/s，LUK的kcat值為13.3/s。其中［E］表酶濃度，Vm表最大反應速度，v表反應速率，km表米氏常數，［S］表底物濃度，kcat表酶的轉化係數。
（四）尿激酶活力的檢測方法
UK的活力有多種檢測方法，典型的如纖維蛋白平板法、冒泡法、熒光光度法和可見光光度法等。
1.纖維蛋白平板法
本方法是測定UK纖溶性。先製備含纖維蛋白原、纖溶酶原的瓊脂糖混合液，與凝血酶溶液混合後冷藏備用。測試時在塗有上述混合液的表麵皿上用特製的打孔器加入標準和未知的UK樣品。37℃保存16h後用遊標卡尺測定溶圈大小。理論上UK活力與溶圈麵積的對數成正比。此方法主要缺點為操作複雜，且影響因素較多，容易產生不必要的誤差。
2.冒泡法
冒泡法與纖維蛋白平板法原理基本相同，不同之處主要在於測量數據為UK溶解凝結了的蛋白質溶液，使其中的氣泡上升的時間。理論上UK活力與氣泡上升的時間成正比。