當蛋白質達到足夠的純度時，就可以進行蛋白質的結晶。結晶作用有三個重要意義：一是作為一種穩定的儲存方法；二是使樣品達到高度均一狀態的必要的純化步驟，可認為是純化後期的一個部分分級法；三是長成單晶後提供作為X射線衍射分析蛋白質結構用的材料。
一、基本原理
蛋白質結晶作用主要由兩個因素決定：一是熱力學平衡因素，即它的溶解度；二是動力學因素，即控製晶核過程和晶核生長。
將一種溶質放入一種溶劑中，由於分子的熱運動，必然發生兩個過程:① 固體的溶解，即溶質分子擴散進入液體內部；②物質的沉積，即溶質分子從液體中擴散到固體表麵進行沉積。一定時間後，這兩種分子擴散過程達到動態平衡。在給定溫度條件下，與一種特定溶質達到平衡的溶液稱為該溶質的飽和溶液，此時溶液中的溶質濃度稱為該溶質的溶解度或飽和濃度。溶解度的單位有多種，在結晶操作中常用單位質量(或體積)溶劑中溶質的質量表示(如g/100g水)。溶解度是溫度的函數，因此，溶質在特定溶劑中的溶解度常用溫度-溶解度曲線表示，該曲線又稱飽和曲線，的曲線1所示。大多數物質的溶解度隨溫度的升高顯著增大，也有一些物質的溶解度對溫度的變化不敏感，少數物質(如螺旋黴素)的溶解度隨溫度升高而顯著下降。在物性不同的溶劑中溶質的溫度-溶解度曲線是結晶操作設計的基礎。
在實際工作中，常常製備一個含有比飽和條件下更多的溶質的溶液，這樣的溶液稱為過飽和溶液。過飽和溶液達到一定濃度時會有固相形成。開始有新相形成時，過飽和濃度和溫度的關係可用過飽和曲線描述，也稱為第二超溶解度曲線曲線3所示。第二超溶解度曲線與溶解度曲線之間的區域稱為介穩區或亞穩區，第二超溶解度曲線以上的區域能夠自發成核，稱為不穩區，溶解度曲線以下的區域為穩定區。在介穩區又存在一定的過飽和濃度，在該濃度以下極難自發形成結晶，這一濃度與溫度之間的關係表示在圖上即為第一超溶解度曲線，曲線2所示。因此，介穩區又分為兩部分，即第一超溶解度曲線與溶解度曲線之間的第一介穩區和第二超溶解度曲線與第一超溶解度曲線之間的第二介穩區。
各個區域內的結晶現象可歸納如下：A穩定區，即不飽和區。在此區域內即使有晶體存在也會自動溶解。B第一介穩區，即第一過飽和區。在此區域內不會自發成核，當加入結晶顆粒時，結晶會生長，但不會產生新晶核。這種加入的結晶顆粒稱為晶種。C第二介穩區，即第二過飽和區，在此區域內也不會自發成核，但加入晶種後，在結晶生長的同時會有新晶核產生。D不穩區，是自發成核區域，瞬時出現大量微小晶核，發生晶核泛濫。
重結晶，就原理而論，是結晶的一種重複過程，可以認為是同一操作的循環過程。本質上，它是在特定條件下物質的分離和純化的問題。對純化來說，為了生產純的或要求的微粒尺寸和從混合物中分離純的晶體，常常需將晶體溶入最少量的熱溶劑中，在其中雜質或不希望有的組分比目標產物更加易溶，然後冷卻溶液，得到純的晶體。在獲得合適純度的產品之前，可能必須重複上述過程許多次。
由結晶獲得的產物，通常應該是很純的，但實際上，總難免有雜質夾帶在其中，這有多方麵的原因:① 某些雜質與產物的溶解度相近，會產生共結晶現象；② 有些雜質會被結合到產品結晶的晶格中去；③ 因洗滌失效不能除去結晶中所有的母液，從而使晶體沾染了雜質。因此需要重結晶，它常能使雜質的濃度降低，提高產品的純度。
二、結晶的影響因素
① 蛋白質純度：純度越高，結晶越容易，但多高純度才能出結晶沒有統一的標準。
② 蛋白質濃度：結晶母液通常應保持盡可能高的蛋白質濃度。濃度越高，結晶機會越大。但在過飽和狀態下結晶，雜質含量多，多是微小晶體，而且晶形不好。對多數蛋白質或酶來說，濃度在10～50mg/mL為好。
③ 溫度：除少數情況外，通常選擇低溫條件進行。低溫條件下蛋白質和酶不僅溶解度低且不易變性。在中性鹽溶液中結晶時，溫度可在0℃至室溫範圍內選擇，在有機溶劑中結晶一般要求溫度較低。通常選擇4℃冷室或25℃溫箱進行結晶。
④ pH：調節pH可以使結晶長到最適大小，也可以改變晶形。結晶的溶液pH一般選擇在被結晶的蛋白質或酶的等電點附近，以利於晶體的析出。
⑤ 沉澱劑：沉澱劑可改變蛋白質的溶解度。鹽類和部分有機溶劑可用作沉澱劑。大多數鹽類影響蛋白質的溶解度是通過鹽析或鹽溶作用。
⑥ 金屬離子和離子強度：離子強度對蛋白質的溶解度影響極大。金屬離子能引起或有助於蛋白質的結晶過程。有些金屬離子(特別是二價的)有促進結晶長大的作用，如在硫酸銨溶液中的鐵蛋白，加入少量鎘離子後能形成菱形結晶，烯醇化酶也常加入汞鹽後形成結晶。