DNP-氨基酸見光易分解，所以整個操作應在暗處進行。DNFB與蛋白質的反應。
（2）丹磺酰氯法丹磺酰氯（DNS）是一種熒光試劑，能專一地與N末端的α-氨基反應，生成氨磺酰衍生物DNS-肽，經鹽酸水解，得DNS-氨基酸和其他遊離氨基酸。
反應產物DNS-氨基酸在紫外線下有強烈熒光，檢測靈敏度可達10-10～10-9mol，比DNFB法高100倍。而且水解後的水解物不需提取，相應的DNS-氨基酸可直接用電泳或色譜法鑒定。
（3）苯異硫氰酸酯法與氨基酸的α-氨基一樣，多肽或蛋白質的N末端氨基也能與苯異硫氰酸酯（PITC，Edman試劑）作用，生產PTC-多肽或蛋白質，在酸性有機溶劑中加熱時，N末端的PTC-氨基酸發生環化，生產苯乙內酰硫脲的衍生物（PTH-氨基酸），並從肽鏈上脫落下來，而剩下的肽鏈仍然完整。PTH-氨基酸經有機溶劑抽提幹燥，可用薄層色譜、氣相色譜、HPLC等鑒定。此法還可用來測定氨基酸序列，即Edman降解法，見後麵“肽段的序列測定”。
（4）氨肽酶法對於用DNS法不能確定的N末端或者要測定對酸水解不穩定的殘基，可用氨肽酶裂解法。氨肽酶可從N末端開始順序切下殘基。但由於切下的速度不同，可能導致結果難以解釋。亮氨酸氨肽酶優先釋放疏水氨基酸，但釋放酸性殘基的速度則非常慢。氨肽酶具有較廣的專一性。此法的靈敏度不如DNS法。
（5）封閉N末端的測定N末端封閉的蛋白質或肽不能與上述試劑反應。N末端殘基封閉的情況很多，例如乙酰化（兔肌紅蛋白）、甲酰化（蜂毒素）、焦穀氨酸環化（兔免疫球蛋白）、丙酰氯環化及個別多肽形成的環狀分子（短杆菌酪肽A）等。
降解N末端焦穀氨酰殘基的方法有酶解法和化學降解法兩種。酶解法用焦穀氨酸氨肽酶，專一裂解焦穀氨酰N末端的，用色譜法鑒定，剩餘肽鏈可正常測序。
化學降解法是用HCl-甲醇試劑。在溫和條件下，該試劑能打開焦穀氨酰殘基的吡咯烷酮環，暴露其α-氨基。
用HCl-甲醇反應後，使穀氨酸殘基上帶一個γ-甲基酯，暴露的α-氨基則能被Edman試劑偶合，然後按正常方法降解。
N末端甲酰基可通過溫和酸水解法除去，而不致引起肽鍵嚴重裂解，或者用來自大腸杆菌的脫甲酰基酶除掉。
（二）C末端的測定
蛋白質C末端測序方法主要有化學法、羧肽酶法和串聯質譜法。
1.化學法
化學法包括（異）硫氰酸法、過氟酸酐法、肼解法和還原法等。
（1）（異）硫氰酸法（異）硫氰酸法，又稱Schlack-Kumpf降解，原理類似N末端Edman降解。（異）硫氰酸與蛋白質或多肽的α-羧基反應，形成蛋白質或多肽乙內酰硫脲，再用裂解試劑切下C末端殘基，形成氨基酸乙內酰酸脲，然後利用HPLC係統分離分析遊離的氨基酸乙內酰酸脲，根據在HPLC上保留時間來確定氨基酸殘基。步驟如下：
① 活化：C末端自由羧基與乙酸酐反應生成混合酸酐，並進一步環化成咪唑團，而側鏈上的羧基形成的混合酸酐則難以成環。C末端的咪唑團在四丁基硫氰酸氨的作用下，轉化為乙內酰硫脲（TH）。
② 酰胺化保護側鏈羧基：側鏈羧基形成混合酸酐後，與硫氰酸呱啶進一步作用形成酰胺，以保護側鏈。
③ 烷基化：由於C末端環化成的TH衍生物較為穩定而不易被切割，因此產率不高。用溴代甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成烷基化-乙內酰硫脲（ATH）衍生物，裂解產率將大大提高。
④ 修飾Thr和Ser的羥基：蛋白質和多肽中的羥基會幹擾測序，因此需要修飾。在活化過程中，乙酸酐也會與羥基反應將其乙酰化，但反應不完全，在N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐的共同作用下，Thr和Ser上的羥基基本被乙酰化。
⑤ 裂解和衍生：C末端的ATH衍生物在酸性條件下與[NCS]-反應，而被裂解生成ATH-氨基酸，新的C末端自動形成TH，而不必重新活化。
因此，整個測序過程隻需在開始時對C末端進行一次性活化，並修飾Asp和Glu側鏈羧基，以及Thr和Ser的羥基。實際上循環反應的隻有烷基化和裂解兩步。
（2）過氟酸酐法原理是C末端氨基酸殘基的α-羧基與混合酸酐反應後，通過酮-烯醇轉換成氧氮雜環戊酮（唑酮），然後利用過氟酸或TFA，把這個環從C末端截掉。然後反應依次連續進行。用質譜測定反應產物的分子質量，通過相鄰分子質量的差值就可以得到其C末端序列。
（3）肼解法蛋白質或多肽與無水肼共熱發生肼解，除C末端氨基酸以遊離形式存在外，其他氨基酸都轉變為相應的氨基酸酰肼化物。氨基酸酰肼可與苯甲醛作用變為水不溶的二苯基衍生物而沉澱，借助DNS法或DNFB法可鑒定C末端氨基酸。
（4）還原法肽鏈C末端氨基酸被硼氫化鋰還原成相應的α-氨基醇，水解肽鏈後以色譜法鑒定。
2.羧肽酶法
羧肽酶是一類外肽酶，專一地從肽鏈的C末端開始逐個降解，釋放出遊離氨基酸，為常用4種羧肽酶的性質及其酶解條件。釋放氨基酸的檢測有：① 色譜法，直接檢測釋放的氨基酸；② 質譜法，測定相對分子質量的差值推斷所釋放氨基酸。
3.串聯質譜法
串聯質譜（MS/MS）是指能夠進行多級質譜分析的質譜儀。原理是將蛋白質經胰蛋白酶或其他酶酶切後，直接用串聯質譜測定酶切肽段混合物，然後通過一級質譜選擇C末端肽段離子進行串聯質譜分析而得到C末端序列。串聯質譜法測定蛋白質C末端序列的關鍵是對C末端肽段的判斷。對於已知序列的蛋白質，可根據序列和酶切位點計算出C末端肽段的理論相對分子質量。對於未知序列的蛋白質，則C末端肽段的判斷有18O標記法和Anhydrotrypsin法。
四、肽鏈的專一性水解和肽片段的純化
（一）肽鏈的專一性水解
最普遍有效的Edman降解法測肽鏈序列，一次隻能連續降解數十個殘基，故需將多肽先裂解成較小的肽段，分別測定。裂解時要求裂解點少，專一性強，收率高。方法基本分兩大類：化學法和酶法。
1.蛋白質的化學裂解
化學法裂解的肽段一般較大，適於在自動序列分析儀中測定序列，同時有利於肽段的吻合，所以化學法對較大分子質量的蛋白質的序列測定是很重要的。
（1）CNBr裂解CNBr能專一裂解Met殘基的C末端肽鍵，產率達85%。CNBr與蛋白質中Met側鏈硫醚基反應，生成溴化亞氨內酯，此產物與水進一步反應，將肽鍵斷裂。
反應在酸性介質中進行，此時巰基也能發生反應，但不切斷肽鏈。若事先用烷基化試劑保護巰基，可防止此反應發生。蛋白質一般含Met較少，所以CNBr裂解蛋白質能得到大的肽段。而Met如被氧化成碸或亞碸，則不能發生裂解反應，所以整個反應要在氮氣容器中進行。CNBr相對Met要過量50～100倍（摩爾比），反應時間通常為24h。
CNBr對Met-Ser、Met-Thr鍵的裂解率不高，因為它們進攻亞氨內酯中間物，Met變成高絲氨酸殘基，而未裂解肽鍵，當CNBr∶Met達500∶1時，可克服幹擾作用。
CNBr裂解采用的酸性條件，可引起蛋白質中其他肽鍵的裂解，特別是Asp-Pro鍵。如果某一序列含有這個鍵，則所得肽段數目要比根據Met量所預計的數目多。
（2）BNPS-Skatole法BNPS-Skatole是一種溫和的氧化劑和溴化劑，Trp裂解產率通常在40%～70%，蛋白質中含Trp很少。
BNPS-Skatole試劑不太穩定，對光敏感，所以反應要在暗處進行，試劑在Trp殘基的C末端一側裂解肽鍵。該試劑對Lys、His也能作用而形成幹擾。
（3）X-Cys鍵的裂解有兩種試劑可用於裂解含Cys殘基的肽：2-硝基-5-硫氰苯甲酸（NTCB）和（2-甲基）-N-1-苯磺酰-N-4-（溴乙酰）醌二亞酰胺（也稱Cyssor，因為專一性剪切半胱氨酸而得名）。這兩種試劑都是在半胱氨酸的N末端側發生裂解。裂解產率大於90%。
（4）羥胺裂解NH2OH在pH9.0下能裂解Asn-Gly間的肽鍵，此法專一性不是很好，Asn-Leu和Asn-Ala鍵也能部分斷裂。由於各種蛋白質中Asn-Gly出現幾率很低，故此法所得到的肽段很大。其反應機理是，通過羥胺作用形成一個琥珀酰亞胺環狀物，最後導致Asn-Gly鍵的裂解，
（5）Asp-Pro鍵的裂解蛋白質中的Asp-Pro鍵對酸特別不穩定，在稀酸條件下，Asp-Pro鍵就能斷裂。
2.蛋白質的酶法裂解
酶法裂解的優點是，專一性強，降解後的肽段容易純化，產率較高，副反應少，在酸水解中容易受破壞的Gln、Asn和Trp等在酶解中都不受影響。用酶解法裂解肽鍵要考慮以下幾種因素：pH、溫度、蛋白質與酶的比例、反應時間、蛋白質物理狀態等。裂解肽鏈的蛋白質水解酶。