一、基本原理
蛋白質和多肽是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長鏈，然後通過鏈內、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進行折疊卷曲形成一定的構象並發揮其獨特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質的一級結構決定了蛋白質的高級結構及功能。因此，分析蛋白質的氨基酸序列是進行蛋白質結構功能研究中不可缺少的部分。
進行氨基酸序列分析，至少采用兩種方法分別裂解多肽（裂解位置不同），分別純化並測定產物氨基酸序列，比較兩套肽段序列，找出斷裂點相重疊部分（接頭部分），即可得到完整的氨基酸序列。對於一次不能連續測出序列的大肽段，需進一步裂解。若多肽鏈含有二硫鍵或其他配基，如酰氨基時，還需要分別確定它們在序列中的連接位置。
二、氨基酸序列分析程序
（一）測序準備工作
在氨基酸序列分析前，必須做好樣品的準備工作。內容包括：
（1）樣品的純度鑒定采用多種互補有效的手段鑒定蛋白純度，如SDS-PAGE、RP-HPLC、CE、IEC、親和層析、肽（酶）譜分析等。
（2）脫鹽方法有RP-HPLC、凝膠過濾、透析、超濾、丙酮沉澱法等。
（3）巰基修飾方法有丙烯酰胺修飾（包括還原、烷基化、脫鹽），4-乙烯吡啶修飾（包括還原、烷基化、脫鹽）等。
（4）蛋白質的分子質量測定早期采用超離心分析和光散射法，目前常用方法有：SDS-PAGE法、凝膠過濾法、CE和質譜等。
（5）構成蛋白質的多肽鏈的數目和大小多肽鏈的數目通常可以從測定每分子蛋白質所含的N末端殘基數，結合SDS凝膠電泳推導出來。若肽鏈之間非共價交聯，可用高濃度變性劑（如8mol/L尿素）或解聚劑（如SDS）拆離，將各種鏈分離純化，然後分別測定各鏈的一級結構。若肽鏈是由二硫鍵共價交聯，就得選用適當的化學反應斷裂二硫鍵，並將斷裂後出現的巰基保護起來，然後將各種鏈分離純化，再進行各個肽鏈的一級結構測定。拆開二硫鍵的方法有過甲酸氧化法、還原-羧甲基化法等。
（6）蛋白質的氨基酸組成根據分子質量和氨基酸組成，可計算其中各種氨基酸殘基數目，以指導裂解蛋白質方法的選擇。
（7）蛋白質的端基分析端基分析有助於判斷蛋白純度，後續分析中識別N末端和C末端，有助於肽段拚接，也可以判斷N末端是否封閉或酰胺化等。
（二）蛋白質的水解
（1）鹽酸水解法此法應用普遍，能較滿意地得到Trp和Cys以外的其他所有氨基酸，而且較為簡便。具體方法如下。
使用5.7mol/LHCl，真空狀況下於110℃水解24～72h，在150℃下快速水解90min。Woodword等人用微波輻射法（150℃，20～25min）來水解蛋白質。通常情況下，水解後大部分氨基酸可定量回收，但Trp基本全被破壞，需借助其他方法。Ser、Thr分解緩慢，要準確測定，需要做幾個水解時間實驗，然後測定氨基酸含量，再推算分解時間為零時的氨基酸含量。含Val、Ile的肽鏈，因支鏈空間障礙而水解緩慢，故定量測定比較耗時。Cys可被部分破壞和氧化，宜在氧化成穩定的磺基丙氨酸後測定。Gln和Asn在酸水解中脫酰胺後變成Glu和Asp，測定水解釋放出的氨量以計算Asn和Gln的總量，或者用不水解酰胺的方法水解肽鍵後直接測定。HCl水解時，Met易被氧化轉變為甲硫氨酸碸，損失約20%，可以用這一數值進行校正，也可用保護劑（在鹽酸中加入0.1%～1.0%巰基乙醇）來減少水解中Met的損失。HCl水解中Tyr的破壞率約為10%，若水解時加入0.1%～1.0%巰基乙酸和0.05%～0.1%苯酚，能明顯提高Tyr、Ser回收率，同時Met也能免遭破壞。
（2）磺酸水解法磺酸是非氧化性強酸，用4mol/L甲基磺酸，含0.2%β-吲哚基乙胺（色胺）進行水解，可使Trp的回收率達到90%以上，Ser和Thr的回收率接近定量值。其中Cys可用DTT還原水解液中的胱氨酸及其衍生物，然後用過量的連四硫酸鈉氧化，得到S-磺基半胱氨酸而加以測定。
（三）氨基酸的分離和定量測定
以IEC法分離氨基酸可分為柱後反應法和柱前衍生法兩大類。前者是將遊離氨基酸經過色譜柱分離後，再與顯色劑（如茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛）反應。此法對樣品預處理要求低，比較穩定，容易操作，缺點是靈敏度不高，操作時間長；後者是氨基酸先與化學偶聯試劑作用，形成氨基酸衍生物，再經過色譜柱分離，直接檢測衍生物。此法可檢測OPA-、PTC-、PTH-、DABS-、Dansyl-和DABTH-氨基酸，靈敏度高，可利用HPLC分析，缺點是衍生物的不穩定性會幹擾檢測。
（1）茚三酮法IEC後，氨基酸與茚三酮反應形成紫色產物，可於570nm比色測定，摩爾消光係數2×104。而蛋白質與茚三酮形成的黃色產物，於440nm比色測定，摩爾消光係數3×103。測定樣品前，先用已知濃度的標準氨基酸的混合物做一次色譜分析，根據標準氨基酸的峰位、麵積等參數來推算樣品中的氨基酸。17種標準氨基酸混合液在氨基酸自動分析儀上的分析。
（2）熒光胺法室溫下迅速和一級胺反應，產物的激發波長390nm，熒光波長475nm。
(3）OPA法在巰基乙醇存在下，OPA能與一級胺作用生成具有強熒光的異吲哚衍生物，激發波長340～360nm，熒光波長455nm。
（4）苯氨基硫甲酰衍生物分析法堿性條件下，異硫氰酸苯酯（PITC）與氨基酸反應形成苯氨基硫甲酰衍生物，在254nm檢出。
（四）特殊氨基酸的測定
1.Trp的測定
由於Trp在酸水解後幾乎全部破壞，需通過其他方法如堿水解（5mol/L NaOH）來測定。另外介紹以下兩種方法：
（1）紫外吸收法Trp和Tyr在280nm和290nm的紫外區有光吸收，可用完整的蛋白質進行Trp測定。先將蛋白質樣品溶於6mol/L鹽酸胍溶液中，然後分別在280nm和288nm測量蛋白質溶液的光吸收。Trp在288nm和280nm的摩爾消光係數分別是4815和5690；Tyr在288nm和280nm的摩爾消光係數分別是385和1280。根據比爾定律，可得如下式子：
在測得Tyr殘基數的基礎上，根據上式求Trp的殘基數。
（2）對-二甲基氨基苯甲醛法Trp在強酸條件下與醛反應生成帶色產物。顏色的深淺與Trp的量成線性關係。該帶色物質的最大吸收峰位於590nm，該法運用廣泛，結果可靠。
2.巰基測定
主要方法有形成硫醇鹽法、烷基化法和比色法，根據試劑與巰基反應後生成帶色產物來進行測定的。
（1）5,5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）測定法DTNB也稱Ellman試劑，易溶於水，在巰基化合物的存在下，無色的DTNB將被轉變成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸，在412nm處具有最大吸收，DTNB的吸收光譜並不幹擾巰基的測定。
（2）萘醌測定法萘醌與巰基有當量加成關係，加成物在420nm左右有吸收峰，標準物和未知物在相同條件下測定，光密度增值與巰基濃度的關係在一定濃度範圍內符合比爾定律。
3.二硫鍵的測定
（1）Ellman試劑法當有一遊離巰基存在時，Ellman試劑可與二硫鍵發生反應。雖然釋放出的ES-（CNT）數與巰基數相等，但二硫鍵已被ES-裂解，形成DTNB（用ESSE表示）的衍生物（-S-S-E）。
Ellman試劑法測定二硫鍵的原理圖在pH10.5堿處理與DTNB反應的蛋白質，則又從-S-S-E中釋放出所有的CNT，這時發生堿催化的β-消除反應。
實際測定是先製成2mol/L硫氰酸胍、3mmol/L EDTA的蛋白質溶液並按前邊提到的巰基測定法測定釋放出的CNT量。然後再將這個溶液的pH調到10.5，再測定CNT量。二硫鍵的數目可按下式計算：
若蛋白質沒有活潑巰基，可加入含巰基化合物，如Cys、穀胱甘肽和DTT，以啟動此反應。
（2）2-硝基-5-硫代苯磺酸法過量亞硫酸鈉與蛋白質反應可裂解蛋白質中的二硫鍵，如下式所示。
由於DTNB也與亞硫酸鹽作用，因此不能用來測定由亞硫酸鹽產生的蛋白質巰基的濃度，然而，2-硝基-5-硫代苯磺酸可用於測定這種情況下的巰基，因為它不與過量的亞硫酸鹽反應，但能與亞硫酸鹽釋放的巰基作用，反應如下式所示：
實際測定時，含二硫鍵的蛋白質與2-硝基-5-硫代苯磺酸在暗處反應後，於412nm測定光吸收，用CNT的消光係數1.14×104L/（mol·cm）計算巰基數，此巰基數就是蛋白質中二硫鍵的數目。
三、末端氨基酸的測定
末端分析可分為N末端測定和C末端測定兩方麵。
（一）N末端的測定
組成蛋白質每條多肽鏈的第一個氨基酸與內部氨基酸不同，它具有α-氨基，並稱為N末端。化學法是先形成對酸較穩定的氨基衍生物，然後水解多肽，釋放出標記的N末端氨基酸衍生物。酶學方法是用外切酶按順序從N末端釋放氨基酸。
（1）二硝基氟苯法2,4-二硝基氟苯（DNFB，或稱Sanger試劑）在溫和條件下（pH8.0～9.0，室溫）與肽鏈的N末端氨基作用，形成DNP-肽或DNP-蛋白，經HCl水解，除N末端氨基酸為黃色的DNP-氨基酸衍生物外，其餘均為遊離氨基酸。雖然多肽側鏈上ε-NH2、酚—OH等也能與DNFB反應，但在用有機溶劑抽提時將與遊離氨基酸一起留在水相，而與α-DNP氨基酸區分開來，可用紙層析、薄層層析、HPLC等進行鑒定和定量。