2000年，季莫申科與總統庫奇馬的關係逐漸惡化，重新卷入拉紮連科醜聞。2000年8月，季莫申科的丈夫因為向前總理拉紮連科行賄被捕入獄。2001年1月15日，烏克蘭國家總檢察院以走私和偷稅漏稅罪名對她正式提出指控，稱季莫申科涉嫌從1997年到1999年，私吞公款11億美元，偷稅漏稅15萬美元。1月19日，庫奇馬總統簽署命令解除了她的職務。2月13日，季莫申科被警方正式逮捕。
烏總檢察院逮捕季莫申科後，又對她提出了新的指控：警方懷疑她在“統一能源係統公司”任職期間，曾向拉紮連科行賄7900萬美元。據調查，季莫申科在任烏克蘭“統一能源係統公司”總裁期間，曾與政府官員勾結，從俄羅斯走私天然氣達30億立方米，獲利達4.45億格裏夫納（約合8000萬美元）。在走私天然氣過程中，她使用了偽造的文件並利用犯罪團夥達到目的。同時，俄羅斯軍事檢察總院也懷疑季莫申科與俄國防部軍事財政和預算總局局長奧列尼科將軍瀆職案件有牽連。他們兩人在任職期間，曾促成俄國防部與烏“統一能源係統公司”簽署了一項價值為4.5億美元的電力供應合同，雙方均從合同中獲得一筆不菲的收入。奧列尼科將軍已被俄警方逮捕，俄羅斯當時就希望能提審季莫申科。2001年4月2日，烏克蘭最高法院裁定，基輔佩切爾區法院2001年3月27日關於釋放烏克蘭前副總理季莫申科的判決有效，暫停實施基輔市法院2001年3月30日關於再次逮捕季莫申科的決定。烏最高法院院長博伊科當天審議了季莫申科的律師的上訴，並裁定基輔市法院在審議該案件時沒有遵循烏刑事訴訟法的司法監督程序。
2005年1月26日，俄總檢察長烏斯季諾夫表示，盡管尤利婭·季莫申科已被任命為烏克蘭臨時總理，但俄方對她的刑事犯罪調查並未取消。因此，這位“鐵娘子”仍是俄全球通緝的嫌犯，她的名字仍被列在國際刑警組織全球通緝的黑名單上。因行賄被俄方立案。俄軍事檢察院總檢察長薩文科夫稱：“根據俄刑法第291條，季莫申科被指控犯有行賄罪。”1996年，季莫申科擔任“烏克蘭統一能源公司”總裁期間，曾向俄國防部的5名軍官行賄，使俄國防部以高出實際價格的收購價從該公司進口了約8000萬美元的產品。
烏克蘭總統尤先科8日突然下令解散由美女總理季莫申科領導的政府，任命第聶伯羅彼得羅夫斯克州州長尤裏·葉哈努羅夫為代總理。消息傳出後，輿論開始紛紛揣測尤先科“拿下”季莫申科的真正原因。不過，早在季莫申科被撤職的消息傳出之前，就已經有人預測季莫申科的總理位子肯定坐不長了，其中就包括烏總統編外顧問、俄右翼力量聯盟領導人之一涅姆佐夫9月8日所說的一番話。
涅姆佐夫8日暗示說，“尤先科·季莫申科”這套在天鵝絨革命期間打造的雙輪馬車已很難再走下去。涅姆佐夫說，烏克蘭國內目前的政治危機主要是是由總統尤先科與總理季莫申科的意識形態衝突造成的。尤先科堅持烏克蘭走建立在民主與自由基礎上的歐洲發展道路，而季莫申科則主張以“家長作風”和“民粹主義”走出一條特殊的道來。
“除政治危機外，烏克蘭目前還陷入了誰也不曾料到的經濟危機，這主要表現在工業生產從13%下降到了2.5%。不僅如此，在豐收之後，烏克蘭還出現了少見的通貨膨脹，燃料、肉類和麵包的價格上漲。經濟投資急劇減少，資金大量外流，等等”，涅姆佐夫說，“所有這些都是由季莫申科政府外行造成的。”
涅姆佐夫指出，“我對季莫申科的主要批評是她製造了烏克蘭的不良投資環境，對此，烏克蘭卻沒有人願意說，尤先科的立場是明晰且正確，她不但不聽，而且所有人都對著幹，我不敢設想如果普京給弗拉德科夫（俄總理）下達指示，而弗拉德科夫不但什麼都不做反而對著幹會是什麼樣子。”
烏克蘭前總理季莫申科的新聞發言人索羅卡2010年5月11日說，烏總檢察院已傳喚季莫申科接受刑事案件調查。索羅卡說，季莫申科被要求於當地時間12日上午10時前往總檢察院調查局。她表示，季莫申科可能會遭到刑事調查和被限製人身活動自由。據烏克蘭總檢察院新聞處透露的消息，檢察官將向季莫申科遞交關於限製人身活動自由的決定，要求她配合一起刑事案件調查。