然而，正是由於她與載淳的關係和對他的照顧遠遠超過載淳的生母慈禧太後，才引起慈禧太後的猜忌。而且慈安太後為人寬厚仁愛，在宮中、在同治帝心中具有崇高地位和影響力，這更是意欲專權的慈禧太後所不能容忍的。
穆宗死後，載湉被立為帝，即德宗，亦稱光緒皇帝。由於德宗皇帝即位時年紀尚幼，兩宮皇太後二次垂簾聽政。這時雖然是二人同時訓政，但慈安太後已無一分權力。實權都掌握在慈禧太後手中。在光緒年間，她誠心信奉佛教，在宮中天天以吃齋念佛為主要功課。這樣，慈禧太後更覺無所約束，益加肆意弄權，膽大妄為了。
光緒一朝，慈安太後日益倦怠不聞外事，而慈禧太後則日益振奮統攝全局大權獨攬。從生活上說，慈安太後崇尚節儉，不事鋪張，而慈禧太後卻肆無忌憚地揮霍。慈禧太後經常單獨召見大臣，決定大事要事逐漸地也不再告知慈安太後。過去她哪敢這樣做，像同治年間補瑞麟為文華殿大學士，這樣的大事，她都要找慈安太後商量，取得慈安太後的同意後才可以實施。後來慈安太後竟成了可有可無之人，這使慈安太後心內憤憤不平，兩人之間的矛盾也逐漸突出起來。
沒過多久，慈安太後突然暴薨了。
光緒七年（1881年）三月初十日戌時，慈安逝於鍾粹宮，終年45歲。慈安之死，事先並沒有什麼明顯的征兆。三月初九日，慈安身體稍感不適，第二天晚上就死了。光緒帝對慈安的猝然而逝，深為不解：“初九日，慈躬偶爾違和，當進湯藥調治，以為即可就安。不意初十日病情陡重，痰湧氣塞，遂至大漸，遽於戌時仙馭升遐。”
事出太過突然，令朝野皆驚。
慈安太後為人慈祥和藹，以仁厚著稱於大內，平日很少責罰太監、宮女。有時小太監的衣服掛破了，她還親自給縫上。她的猝然薨逝，使鍾粹宮的太監、宮女們如喪考妣，一時間哭聲慟天。那班大臣們聽了，個個麵麵相覷，目瞪口呆。內中恭親王最是關心，聽後便禁不住號啕大哭起來。諸大臣勸住了恭親王的哭，趕進東太後寢宮去，見慈禧太後坐在矮椅上，宮女們正在替東太後入殮。大臣們看了這個情形，忍不住個個掉下眼淚來。隻聽得西太後自言自語地說道：“東太後一向是一個好身體，近來也不見害病，怎麼忽然丟下我去了呢？”慈禧太後一邊數說著，一邊伏在屍身旁嗚嗚咽咽地痛哭起來。諸位大臣見西太後哭得傷心，便一齊跪下來勸解著，說皇太後請勉抑悲懷，料理後事要緊。照宮廷的舊例，凡是帝後上賓，所有藥方醫案都要交軍機大臣驗看；如今東太後死得這樣快，所以也不及延醫服藥，也不曾留得方子。後妃死後，照例又須召椒房戚族進宮去看著入殮。如今西太後的主意，不叫去通報東太後的母家鈕鈷祿氏的族人，大臣們也沒有人敢反對，一任那班宮女在那裏替東太後草草成殮。慈禧太後同時把一班軍機大臣召喚到自己書房裏去，商量擬遺詔的事體。
那遺詔上說道：
予以薄德，隻承文宗顯帝冊命，備位宮閫；迨穆宗毅皇帝寅紹丕基，孝思純篤，承歡奉養，必敬必誠。今皇帝入纘大統，視膳問安，秉性誠孝。且自禦極以來，典學維勤，克懋敬德，予心彌深欣慰！雖當時事多艱，宵旰勤政，然幸體氣素稱強健，或冀克享遐齡，得資頤養。本月初九日，偶染微病，皇帝侍藥問安，祈予速痊；不意初十日病勢陡重，延至戌時，神思漸散，遂至彌留。年四十有五，母儀尊養，垂二十年；屢逢慶典，迭晉徽稱，夫複何憾！第念皇帝遭茲大故，自極哀傷；惟人主一身關係天下，務當勉節哀思，一以國事為重，以仰慰慈禧端佑康頤昭豫莊誠皇太後教育之心。中外文武，恪供厥職，共襄郅治；予靈爽實共與嘉之。其喪服酌遵舊典，皇帝持服二十七日而除；大祀固不可疏，群祀亦不可輟。再予向以儉約樸素，為宮闈先，一切事關典禮，固不容驕縱抑損；至於飾終遺物，有可稍從儉約者，務惜物力，即所以副予之素願也。故茲昭諭，其名遺行。
一道遺詔，便輕輕把一樁絕大的疑案掩飾過去了。那孝貞皇太後的家族也不敢問信。光緒七年（1881年）九月二十七日，慈安被安葬在普祥峪定東陵，諡號“孝貞慈安裕慶和敬誠靖儀天祚聖顯皇後”。