此時，弗萊明意識到如果繼續研究盤尼西林在臨床上的使用，恐怕會得不償失，因此他沒有去做關鍵性的動物保護性試驗，而這些試驗極有可能能揭示出盤尼西林真正具有的殺菌功能。從此，弗萊明放慢了研究盤尼西林的工作速度。
在1930年以後的10年時間裏，弗萊明陸續發表了27篇論文，他一直將盤尼西林作為出售的疫苗進行生產，他並不鼓勵別人去做盤尼西林的提純工作，他自己對此也毫無興趣。1936年，磺胺產生了，這更使得盤尼西林黯然無光，人們幾乎忘卻了盤尼西林。
第一篇關於盤尼西林的文章發表了，以後的盤尼西林論文又陸續發表了。這些論文像離弦的弓箭一樣，射出去就不再屬於弗萊明，它是全世界的人的財富。盤尼西林在它的發現者那裏受到了冷遇，但這些冷遇完全被牛津試驗者的熱度所彌補，一位名叫歐內斯特·金的研究酶的化學家讓盤尼西林煥發了青春。歐內斯特·金在收集文獻時發現了弗萊明的盤尼西林論文，他對弗萊明關於溶菌酶的設想十分感興趣，隨即他就將論文交給了著名的病理學家弗洛裏。由於弗洛裏的關注，盤尼西林才有機會顯示它的效力。不久之後，弗洛裏證明盤尼西林既不是溶素，也不是一種酶，但他對盤尼西林的抗菌效力十分滿意。
1940年5月25日，弗洛裏進行了動物保護性試驗，通過實驗證實了弗萊明的盤尼西林菌株具有強大的殺菌作用，這個發現進一步鼓舞了弗洛裏，他幾乎把牛津大學的係變成一個進一步將盤尼西林用於臨床試驗的工廠。翌年，提純盤尼西林的工廠果然開業。
牛津大學裏有無數敢於嚐試的人不久，弗洛裏將純化後的盤尼西林應用於人體身上，取得了明顯的效果，但遺憾的是他們發表的成果報告並沒有引起公眾的興趣和反響，甚至連弗萊明本人對此也不置可否。
1942 年 8 月，弗萊明有一位朋友患了腦膜炎，雖經磺胺藥物治療，但是沒有什麼效果。眼看病人快死了，弗萊明最後決定采用盤尼西林。他向弗洛裏求援，弗洛裏為他提供了一些盤尼西林並告訴他如何使用。用藥之後，瀕臨死亡的病人奇跡般地恢複了健康。這位社會知名人士使弗萊明大夫馬上成了無數家報紙采訪的中心人物，盤尼西林立刻成了新聞界的寵兒。
盤尼西林治療各種疾病顯示出了神奇功能，這在歐洲引起了一場“盤尼西林旋風”。不久，盤尼西林闖遍天下，成了各科醫生案頭必備的抗菌劑，榮譽像雪崩一樣朝弗萊明湧來。
盤尼西林的問世曾為治療疾病開創了新紀元1945年，弗萊明同弗洛裏、歐內斯特·金分享了諾貝爾醫學和生理學獎金。在這以後的10年裏，弗萊明繼續攀登在科學的道路上，他曾經獲得15個城市的榮譽市民的稱號、25個榮譽學位以及140多次重大獎賞、榮譽和獎勵。
弗萊明既是一位技藝超群的細菌學家，也是一位具有敏銳眼光的觀察家，他受到人類永恒的尊敬。
1955年，這位偉大的“盤尼西林之父”辭別了他精心維護的美好的世界。