回聲定位蝙蝠具有一係列特殊的解剖學、神經學和行為學特征，能夠發出和接收高頻聲波。它們的頭骨中有３塊骨具有適應回聲定位的形態變化。第一塊是細長的莖舌骨（ｓｔｙｌｏｈｙａｌ），用於連接頭骨基部和舌骨器（ｈｙｏｉｄａｐｐａｒａｔｕｓ，由一排小骨組成），支撐咽喉肌和喉。在大多數回聲定位蝙蝠中，莖舌骨的頂部延伸成槳狀，有助於將舌骨器固定在頭骨上。
其餘兩塊與回聲定位有關的骨生長在耳中。所有的哺乳動物都是通過一個骨鏈接收聲波的。這就是眾所周知的聽小骨（ｅａｒＯｓｓｉｃｌｅｓ），它能夠在鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）和充滿流質的內耳間傳遞聲波。聽小骨中的第一塊骨是錘骨（ｍａｌｌｅｕｓ），回聲定位蝙蝠的錘骨具有一個較大的球狀突起，有助於控製震動。當聲波穿過聽小骨時，會被傳遞到內耳，撞擊呈蝸旋狀且充滿流質的耳蝸（ｃｏｃｈｌｅａ），耳蝸中含有一種與聲波接收有關的特殊神經細胞。
與其他哺乳動物耳蝸大小在頭骨中所占比例相比，回聲定位蝙蝠的耳蝸較大，使它們能夠更好地區別不同頻率的聲波，並從中探測出高頻聲波。
２０世紀４０年代，關於“大多數蝙蝠利用聲波探測物體”的發現證實，回聲定位在蝙蝠成功進化和物種多樣性形成中功不可沒。但是，蝙蝠的飛行和回聲定位這兩種重要的適應性究竟哪個在先？它們為什麼會進化出來，又如何進化出來？學者們一直爭論不休。到２０世紀９０年代，出現了三種相互競爭的假說。
飛行在先假說主張，蝙蝠祖先為了提高運動靈活性、減少捕食消耗的時間和能量而進化形成了動力飛行。根據這一猜想，回聲定位行為隨後進化形成，使早期蝙蝠更易於探測和跟蹤那些原本僅能依靠飛行追逐的獵物。
相反，回聲定位在先假說提出，原始的蝙蝠在樹間滑翔，利用回聲定位捕食飛過它們棲息之處的獵物，回聲定位的形成有助於蝙蝠跟蹤更遠的獵物。而動力飛行的進化在後，是為了提高運動靈活性，使蝙蝠更容易返回原來的捕食地點。
並行進化假說的觀點則是，飛行和回聲定位同時進化。這一假說的基礎是，實驗證據表明，蝙蝠在靜止時發出回聲定位聲波需要消耗大量能量，而在飛行過程中，回聲定位的能耗則可以忽略不計。因為飛行肌的收縮有助於肺部呼吸，從而產生進行密集、高頻發聲所需要的氣流。
驗證關於蝙蝠飛行和回聲定位起源假說的唯一方法就是，將翼和較大的耳蝸等相應特征的分布繪製在蝙蝠係統進化樹上，確定它們分化的位置。然而，在２０世紀９０年代之前，由於未發現具有上述特征的蝙蝠化石，研究者無法判斷蝙蝠飛行和回聲定位的起源。因為與現代蝙蝠一樣，古蝙蝠體型較小、骨骼易碎，而且主要生活在物體腐爛迅速的熱帶棲息地。隻有蝙蝠死亡的地點立刻被沉積物覆蓋，屍體免受腐食動物和微生物等破壞的情況下，才會變成化石。因此，蝙蝠化石非常稀少。
有記錄的最古老、最原始的蝙蝠是５２５０萬年前的食指伊神蝠。２０世紀６０年代，食指伊神蝠在美國懷俄明州著名的綠河地區被發現———這一區域的泥岩和石灰石紋理細密，出土過很多保存完好的魚類、植物、哺乳動物、昆蟲、鱷類爬行動物和鳥類化石。
從那之後的４０年間，伊神蝠成為研究蝙蝠進化最早階段的基礎。諷刺的是，伊神蝠最顯著的特征與現代蝙蝠極為相似：牙齒形狀說明它捕食昆蟲，與大多數現存蝙蝠相同；四肢比例也與現代蝙蝠相似，同樣具有細長的指骨、延長的前臂和短小的後腿。這一物種的肩胛骨（ｓｃａｐｕｌａ）、胸骨（ｓｔｅｍｕｍ）和胸腔結構證明它們完全具有飛行能力。同時，它也具有回聲定位所必需的解剖學結構。
實際上，如果伊神蝠存活至今，將很難與其他蝙蝠區分開來。它們最主要的特征是在食指上長有一個很小的爪（因此這一物種被稱作食指伊神蝠）。大多數蝙蝠隻在拇指上長有爪，因為隨著時間的推移，其餘四指的指尖都退化成柔軟、微小的軟骨而完全包裹在翼膜中了。伊神蝠食指上的爪可能是其陸生祖先殘留下來的。
伊神蝠並不是我們尋找的蝙蝠進化史上“缺失的一環”。但是，從綠河地區出土的另一個蝙蝠物種———屬名為Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ的兩塊化石則可能是這關鍵的一環。這兩塊化石樣本是在過去１０年間，分別由不同的收藏家發掘出來，用於科學研究的。它們出土的岩層與伊神蝠相同，因此二者具有可比性。同時，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ既有原始特征又有現代特征，顯然就是進化生物學家尋找已久的過渡型生物。
之所以將這一蝙蝠物種屬名定為Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ（意思是“有爪蝙蝠”），是因為化石顯示這些蝙蝠五個指上都生長有爪，這與它們的陸生祖先相同。除了有爪之外，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ還有另一個特征讓人聯想到那些不會飛的哺乳動物：與現存所有蝙蝠所具有的很長前肢和短小後肢相比，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉ的前肢相對較短而後肢相對較長。Ｏｎｙｃｈｃｍｙｃｔｅｒｉｓ的四肢比例介於所有已知的蝙蝠（包括伊神蝠）與樹獺、長臂猿等大部分依靠前臂移動的樹棲哺乳動物之間。這些樹棲哺乳動物多數時間吊掛在樹上或在樹木間攀援。蝙蝠可能由具有相似運動方式的樹棲祖先進化而來。
盡管具有原始的四肢特征，但Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ的其他解剖學特征表明，它們能夠進行動力飛行。它較長的指能夠支撐翼膜，有力的鎖骨（ｃｏｌｌａｒｂｏｎｅ）有助於將前臂固定在身體上。同時，較寬的胸腔和具有龍骨的胸骨能夠支撐巨大的飛行肌，具有小麵的肩胛骨能夠支撐其他與飛行有關的專用肌肉。
此外，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ臂骨和指骨的比例說明，它們翼的縱橫比很低，翼尖相對較小。在現存蝙蝠中，隻有鼠尾蝠（ｍｏｕｓｅ－ｔａｉｌｅｄｂａｔ）具有相似的短而寬的翼。鼠尾蝠具有拍翼滑行的特殊飛行模式，即在拍翼飛行期間進行較短的滑行。因此我們推測，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ也有同樣的飛行模式。這種拍翼滑行可能是原始蝙蝠祖先滑翔運動與大多數現代蝙蝠持續拍翼飛行之間的過渡形式。
Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ的發現，不但說明了早期蝙蝠的飛行方式，還為解決蝙蝠何時產生飛行和回聲定位能力的爭論，提供了科學界期待已久的證據。
與其他已知的始新世（Ｅｏｃｅｎｅｅｐｏｃｈ，５５８０萬年前至３３５０萬年前）蝙蝠不同的是，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ似乎並沒有與回聲定位能力相適應的三種骨骼特化：它們耳蝸較小，錘骨隆起也相對較小，莖舌骨的頂部沒有延伸。然而四肢和胸腔的特征明確顯示，它們能夠飛行。因此，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ代表了早期蝙蝠已具備飛行能力但尚未進化形成回聲定位能力的一個階段。化石證據最終給了我們答案：飛行在先，回聲定位在後。
飛行和回聲定位的產生，為蝙蝠的適應輻射（ａｄａｐｔｌｙｅｒａｄｉａｔｉｏｎ）帶來了一個耀眼的階段：在突破某一關鍵性的適應後，蝙蝠迅速分化，形成很高的物種多樣性。現存蝙蝠分為１９科，此外還發現了另外７科的蝙蝠化石。值得注意的是，利用多種基因ＤＮＡ序列計算分化時間的結果指出，所有這２６科的蝙蝠在始新世末期就已經明確分化了。這種“大爆炸”式的多樣性分化，在哺乳動物進化史中是絕無僅有的。
然而，飛行和回聲定位顯然不是影響這種適應輻射的唯一因素。蝙蝠譜係的起源顯然還與年平均溫度上升密切相關，因為溫度升高意味著植物和昆蟲多樣性的升高。從快速飛行的甲蟲到石蛾、蟑螂和微小的振翅飛蛾，空中捕食者可以享用真正的“自助餐”。在始新世的夜空中，作為隻在夜間活動的飛行捕食者，蝙蝠的競爭者很少———隻有貓頭鷹和歐夜鷹，因此，蝙蝠能夠利用豐富的食物資源，迅速地進化和分化。
德國麥塞爾（Ｍｅｓｓｅｌ）地區發現的化石也暗示了這種早期的分化。自２０世紀７０年代在麥塞爾開展科學發掘以來，已經發現了７種蝙蝠化石，包括兩種初蝠（Ａｒｃｈａｅｏｎｙｃｔｅｒｉｓ）、兩種古蝙蝠（Ｐａｌａｅｏｃｈｉｒｏｐｔｅｒｙｘ）、兩種海思亞古蝠（Ｈａｓｓｉａｎｙｃｔｅｒｉｓ）以及一種Ｔａｃｈｙｐｔｅｒｏｎｆｒａｎｚｅｎｉ，其中Ｔａｃｈｙｐｔｅｒｏｎｆｒａｎｚｅｎｉ是至今仍存活的鞘尾蝠科（Ｅｍｂａｌｌｏｎｕｒｉｄａｅ）中最古老的成員。這些化石年齡為４７００萬年，隻比從綠河地區出土的蝙蝠化石晚幾百萬年，但它們之間已經存在很大的差異。
為什麼麥塞爾曾有如此眾多的蝙蝠，這一點不難理解。在始新世，那裏氣候溫和。茂盛的亞熱帶森林環繞著大小不一的湖泊。根據保留下來的化石豐富度判斷，有成千上萬的空中飛行、水生和陸生昆蟲可以讓蝙蝠取食。實際上，在這裏發現的７種蝙蝠化石正好都是食蟲蝙蝠，但是根據保存下來的胃容物分析發現，每種蝙蝠隻是專門捕食某個特定種類的昆蟲。古蝙蝠捕食較小的蛾類和石蛾，海思亞古蝠偏好體型較大的蛾和甲蟲，初蝠隻捕食甲蟲。對於Ｔａｃｈｙｐｔｅｒｏｎ，沒有保留下來的胃容物，但是我們通過牙齒的形狀判斷它也以昆蟲為食。
Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ和伊神蝠以什麼為食？我們尚未發現胃容物，難以確切回答這個問題。根據蝙蝠牙齒形態和綠河岩層中豐富的昆蟲化石推測，昆蟲應該是這兩種蝙蝠較為合適的食物。現存蝙蝠中大多數種類也都以昆蟲為食。在這一種群的進化史中，隻是近期才開始有蝙蝠以肉類、魚、水果、花蜜、花粉甚至血液為食。
麥塞爾和綠河地區發現的化石，為研究者描述蝙蝠起源提供了關鍵證據。但是我們仍然缺少能夠確定蝙蝠與其他哺乳動物親緣關係的化石。樹棲、滑行的哺乳動物（如貓猴）與蝙蝠十分相似，長期以來，科學家一直認為它們之間具有親緣關係。在過去的１４年間，美國加利福尼亞大學河濱分校的馬克·Ｓ斯普林格（ＭａｒｋＳＳｐｒｉｎｇｅｒ）及其他研究者，分析了大量哺乳動物的ＤＮＡ，發現蝙蝠與任何能滑翔的胎生哺乳動物，如貓猴和鼯鼠，都沒有較近的親緣關係（雖然如此，這些動物仍是推測蝙蝠祖先四肢結構的好模型）。
遺傳學分析明確地將蝙蝠劃分在勞亞獸總目這一古老譜係中。勞亞獸被認為可能是在白堊紀晚期，７０００萬～６５００萬年前的時候，在勞亞古大陸上進化的，該地區包括現在的北美洲、歐洲和亞洲。原始的勞亞獸體型可能類似老鼠或鬆鼠，四肢著地走路且捕食昆蟲。這個譜係中的其他現代動物種類包括多種獸類，如犬科動物、有蹄類、鯨、穿山甲、地鼠、刺蝟和鼴鼠。蝙蝠在這個譜係中的具體位置尚未確定，但是大量進化上的改變將Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ和其他蝙蝠與它們的陸生祖先分離開來。
就像遺傳學領域最近的發現所暗示的，蝙蝠從陸生進化到空中飛行的速度是驚人的。盡管以蝙蝠的標準來說，Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉ前肢的指顯得偏短。但與其他哺乳動物相比，其前肢的指仍然延長了許多。這種延長是如何進化的？
在２００６年的《美國國家科學院刊》上，現就職於美國伊利諾伊大學的卡倫·Ｅ西爾斯（ＫａｒｅｎＥＳｅａｒｓ）及其同事指出：在發育過程中控製前肢指骨的生長和延長的關鍵因素，可能與基因的活性有關。他們比較了蝙蝠和小鼠的胚胎發育後發現，發育中指骨軟骨細胞的增殖和生長速度具有顯著差異。一類被稱作骨形成蛋白的蛋白質，在控製這一過程和決定指骨長度中起關鍵作用。這類蛋白中有一種稱作ＢＭＰｓ的蛋白質，在蝙蝠指中的合成量明顯高於小鼠，關閉或調節編碼該蛋白質的基因能夠改變指骨的長度。因此，調節ＢＭＰｓ的基因的微小突變，可能是蝙蝠掌骨發育和進化的基礎。如果事實如此，那就能夠解釋為什麼在短指蝙蝠、不會飛的蝙蝠和長指蝙蝠之間缺失過渡種類的化石，因為進化漂移可能十分迅速，也許根本沒有過渡形態的存在。
盡管關於蝙蝠飛行的進化有了很多新發現，可是仍然存在很多懸而未決的問題。蝙蝠的祖先肯定在始新世之前就存在，但是尚沒有相關的化石記錄。同樣，與蝙蝠親緣關係最近的物種也仍然未知。研究人員迫切地想要解決許多問題，比如蝙蝠在什麼時間第一次從其他勞亞獸中分化出來，早期蝙蝠在北方大陸和南方大陸的進化和多樣性分化達到了什麼樣的程度等。因此，我們還需要尋找比Ｏｎｙｃｈｏｎｙｃｔｅｒｉｓ更接近蝙蝠起源的化石。如果幸運的話，古生物學者可能會發現這樣的樣本，那將有助於揭示這個神秘而迷人的物種的起源之謎。