劍南春大曲曲藥真菌群落結構的分析 徐占成 徐姿靜 唐清蘭
四川劍南春集團有限責任公司，四川綿竹 618200
摘要：以劍南春大曲曲藥為研究對象，采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術研究中溫大曲真菌群落結構及其多樣性。研究結果表明，大曲黴菌優勢種群主要分布在透孢犁頭黴、總狀毛黴、黑曲黴、米根黴等。大曲酵母菌優勢種群主要分布在釀酒酵母、東方伊薩酵母、漢遜酵母、假絲酵母和畢赤酵母等。
關鍵詞：劍南春大曲曲藥；變性梯度凝膠電泳；真菌群落結構
Analysis of the structure of fungus consortium
in the koji of Jiannanchun liquor(baijiu)
XU Zhan-cheng,XU Zi-lan,TANG Qing-lan
Sichuan Jiannanchun Group Co.Ltd.,Mianzhu,Sichuan,618200
Abstract:The mesophilic koji of Jiannanchun liquor was under investigation.The polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis (PCRDGGE) was used to analyze the structure and the diversity of Fungus consortium in the koji of Jiannanchun Liquor. Research results have shown the dominant population of mould in Jiannanchun mesophilic koji are Absidia hyalospora,Mucor racemosus,Aspergillus niger and Rhizopus oryzae.etc.The dominant population of yeasts are Saccharomyces cerevisiae,Issatchenkia orientalis,Hanseniaspora uvarum,Candida tropicalis and Pichia anomala.etc.
Key Words:Jiannanchun mesophilic koji;DGGE;the Structure of Fungus Consortium
1前言
由於我國傳統固態發酵白酒采用開放式生產，白酒微生物種類繁多，群係複雜。所以采用傳統的常規分離培養研究，將會遺漏很多微生物種類，甚至可能是關鍵性功能微生物，當然也就無法知道這部分微生物在整個釀酒微生物生態環境中的作用與分布。大曲中富集有大量的黴菌和酵母菌，這些真菌能產生澱粉酶、酒化酶、酯化酶和蛋白酶等，是白酒糖化、發酵和酯化生香的關鍵生物酶。本研究利用分子生物學技術研究大曲真菌種群結構，通過設計引物，進行擴增產生混合PCR產物，再通過變性梯度凝膠電泳進行分離，從而檢測分析大曲真菌群落結構多樣性特征。
2材料與方法
2.1實驗設備
PCR擴增儀（美國bio-rad）、變性梯度凝膠電泳係統（DGGE）（美國bio-rad）、凝膠成像係統（美國bio-rad）、低溫冷凍離心機（美國熱電）、PCR超淨工作台（Captair）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療機械廠）、移液器（範圍100～1000μL，20～200μL，0.5～10μL）（美國bio-rad）。
2.2實驗材料
劍南春集團有限責任公司生產的大曲曲藥，分子實驗耗材由上海生工提供。
2.3方法
2.3.1樣品總DNA提取
取5g樣品放入滅菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，轉入50mL離心管中。向離心管中加入5mL CTAB提取液（100mmol/L Tris·HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，2%CTAB，pH 8.0）中，37℃振蕩45min。加入20%SDS至終濃度為2%，65℃水浴2h。12000r/min，10min離心，收集上清。上清用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，加入終濃度1/10體積的醋酸鈉（pH5.2）及0.6倍體積異丙醇，4℃沉澱1h。12000r/min冷凍離心20min，收集沉澱，用70%乙醇洗滌2次，晾幹後溶於50μL TE（pH8.0）。測定提取的總DNA濃度，用TE將其稀釋至100ng/μL。