一、發酵的意義
發酵的最初含義是指強烈冒泡的現象，人們最先注意的發酵過程是葡萄汁變為葡萄酒及麥芽汁變為啤酒的過程，在這過程產生大量的二氧化碳，特命名為“發酵”，也就是酒精發酵的過程。以後隨著人們對微生物活動過程及應用的研究日益加深，發酵過程的範圍也就越加廣泛，例如厭氧性微生物形成乳酸、丁酸、醇類，好氧性微生物形成醋酸、檸檬酸等。在微生物的活動過程中生成某些代謝產物，如氨基酸以及抗菌素等，微生物合成維生素、油脂、蛋白質等的過程都歸並為發酵過程，最普遍的是用微生物的生成物來命名，如酒精發酵、乳酸發酵、醋酸發酵、穀氨酸發酵等。因此，發酵的一般說法是利用微生物所分泌的酶的作用，從製醪或製醅中的物質，生成對我們有用的一係列新物質的過程，這一過程是按微生物的生理作用而產生一係列的生化反應。這些反應有的已被研究的比較透徹，如上述發酵，也有些反應其機理還不太明確，如某些香氣成分的形成，還需要進行大量的工作。關於發酵過程中的主要生物化學反應過程，常因產品而不同，有的過程比較簡單，有的包括多種。譬如，醬油醪的發酵就非常複雜，包括：（1）澱粉的糖化；（2）糖分的降解；（3）酒精發酵；（4）蛋白質水解；（5）香氣的形成；（6）生酸反應；（7）酶褐變反應等。這些反應的進行取決於參與發酵的微生物——來自製曲過程，或發酵時自然混入，或人為的加入——和發酵條件的恰當與否。這方麵還有很多的工作要我們去作。
二、發酵技術條件
發酵時酶的作用大部分已在製曲一章曲黴酶係一節中加以敘述，這裏將重點地敘述蛋白酶的作用條件。
1．發酵與蛋白質的水解
成曲的蛋白分解能力直接影響原料大豆蛋白的水解率，所以一直為人所重視。蛋白酶活性的測定一般采用酪蛋白為基質，從酶的基質特異性來講，對大豆蛋白的分解情況和酪蛋白是有差別的。下麵就談談米曲黴蛋白酶對大豆蛋白的分解情況。
作者曾用米曲黴的麩曲，在45～50℃、pH5.0與蒸熟豆餅作用（無鹽）3d達到最高值，水溶性氮達80%，氨基酸態氮達57%。經過多次試驗，分解最適溫度為42～48℃。
曲黴的蛋白水解酶是蛋白酶和肽酶等多酶係。另外曲的生產是開放式的，必然混入細菌，某些細菌很可能是蛋白分解的一部分力量。在作者試驗中就曾發現某些有較強蛋白質分解的菌不是黴菌，而是細菌，並初步證明它們是枯草杆菌。關於這方麵的研究還有待今後的努力。
以上實際是製曲中由各種蛋白酶所組成的混合酶。而酸性蛋白酶（ACP）、中性蛋白酶（NP）及堿性蛋白酶（AIP）對大豆蛋白的水解情況，各不相同。鬆山從米曲分離出酸性蛋白酶，從麩曲分離出中性蛋白酶及堿性蛋白酶，並以精製大豆球蛋白（glycinin）為基質，分別在最適pH（3、6、8）與上述三種蛋白酶作用，測定其所生成的氨基酸：NP的作用相當大，特別是穀氨酸的生成力特別強，AIP次之，ACP最弱，因而適於醬油釀造的黴菌應以生成強大中性蛋白酶者為最理想。在發酵進行蛋白分解這一階段應控製在中性，這樣對提高原料利用率及穀氨酸生成率有好處。
為了提高醬油氨基酸生成率及穀氨酸生成率以改善速釀醬油風味，筆者等篩選出AS3.350黑曲黴，研究其在固體培養條件下的產酶特點及基本性能、證明該菌產酸性蛋白酶較強。不但分解蛋白至氨基酸的能力很強，還能生成較多的穀氨酸。用其在低鹽固態發酵的條件下製出的醬油，與不添加AS3.350黑曲黴的相比，各種氨基酸的生成率均較高，氨基酸生成率在57%左右，醬油鮮味得到提高。
2．食鹽對曲黴酶活性的抑製作用
在醬油及豆醬的生產中，高鹽度降低酶活性的作用相當顯著，這是目前舊生產工藝原料利用率不易提高或發酵周期長的主要原因之一。以前日本很多研究人員均提出過有關食鹽降低酶活的報告，利用蛋白酶製劑試驗食鹽影響的報告也有不少，其結果相同。認為堿性蛋白酶較酸性蛋白酶的耐鹽性較大。筆者等曾試驗AS3.350黑曲黴的植物組織破壞酶對食鹽的耐性，結果如前麵無鹽發酵和有鹽發酵項下所述，除CX纖維素酶可為食鹽所激活，呈現更高的酶活外，半纖維素酶、果膠酶、糖化酶，尤其是對酸性蛋白酶有明顯的抑製作用。采用6%～8%食鹽水製醅的低鹽固態發酵過程中，同樣存在酶活受食鹽抑製作用，使其發酵周期停留在15d左右的水平，無鹽發酵需6d以內，原料利用率達到85%的水平，這是低鹽固態發酵所不能及的。
3．發酵pH對含氮化合物的影響
將蛋白酶溶液放置於室溫，在不同pH條件下觀察了各種蛋白酶的破壞情況，結果pH4.4～6.2範圍內的蛋白酶都未受到破壞，隻有AIP在pH4時稍有破壞。將米曲黴的培養液分別在pH4.5～7.5、30℃保持24h後，分別測定了pH3.0、pH6.0、pH8.5三種酶的活性殘存率，結果ACP在pH4.5相當穩定，pH5.5稍有減少，pH7.5就幾乎失活，NP在pH6.0最穩定，在pH4.5、pH7.5略有減少，AIP在pH4.5～7.5範圍內均較穩定。將醬油曲在30℃、pH1～12處理20min後測定其殘存活性，ACP的穩定pH為2.6～4.0，NP為4.8～5.2，AIP為5.6～6.0及6.0～8.0。
不同pH（7.0～4.5）製醪發酵對全氮的溶解影響曲線。從圖中可以看出，在中性發酵的較好，酸性的較差。正常生產的醬油曲，醬曲或米曲的pH一般在6附近，接近中性，隻有受生酸菌汙染的劣質曲，pH較低，這樣會影響酶的作用，不但全氮溶解率較低，而且還會影響穀氨酸的生成。在25℃、不同pH發酵對遊離穀氨酸的影響。中性發酵的穀氨酸含量最高，其次是對照（pH5.6），發酵pH對穀氨酰胺的影響，穀氨酰胺在製醪初的含量有明顯的差別，在酸性製醪的含量為0.5g/dL，對照含量為0.3g/dL，中性的含量為0.1g/dL。隨著發酵的進行，穀氨酰胺成直線減少，中性製醪的在發酵8d就完全消失，而酸性製醪的卻要75d才完全消失。
焦性穀氨酸在整個發酵期間緩慢增長，高溫發酵比低溫發酵的焦性穀氨酸含量要高。酸性穀氨酸含量高，次為對照，中性的最少。這種傾向在高溫或低溫都是一樣。
製醪發酵pH對醬醪中穀氨酸、焦性穀氨酸、穀氨酰胺三者消長情況影響不但很大，而且左右三者的因果關係，說明了這種關係。在酸性製醪條件下遊離穀氨酸含量低，中性製醪後遊離穀氨酸含量高。相反，穀氨酰胺在酸性製醪中含量高，中性製醪初期幾乎未生成。發酵120d後。穀氨酰胺幾乎全部消失，而穀氨酸及焦性穀氨酸較製醪初期均有所增加。
由以上日本黑島先生寶貴試驗結果可以看出，製醪初期穀氨酰胺的含量是影響穀氨酸或焦性穀氨酸的變化的因素，於是添加穀氨酰胺0.5g/dL於不同pH的醬醪，添加的穀氨酰胺在中性醪中很快地變成穀氨酸，而在酸性醪中穀氨酰胺卻消失得很快，但未變成穀氨酸，而是變成了焦性穀氨酸。
這些變化的主要依據是黴菌所分泌的穀氨酰胺酶，在中性製醪時穀氨酰胺酶的活性得以充分發揮，將大量存在的穀氨酰胺變成了遊離穀氨酸。如在酸性高溫條件下，穀氨酰胺酶受到抑製，反而是適合於穀氨酸變成焦性穀氨酸的條件，結果慢慢變成焦性穀氨酸，這並不是酶的反應，屬於化學反應，溫度越高越易進行。
穀氨酰胺及穀氨酸變成焦性穀氨酸是一種非酶的化學反應，曾按照醬油釀造過程中的穀氨酰胺及穀氨酸的濃度，在37℃觀測了焦性穀氨酸的化學生成，從穀氨酰胺生成的焦性穀氨酸占絕大多數。當穀氨酰胺濃度大時，焦性穀氨酸的生成很少，當濃度在7mg/mL以下時，其大部分變成了焦性穀氨酸，這種情況，溫度、pH的影響不大。進一步觀測了從穀氨酰胺變成穀氨酸的化學變化，而未發現有這一反應的進行。