皮薩羅回到巴拿馬，用西班牙皇帝的援助組建了第三支遠征隊，但是還是不足200人，而他要去征服的是有五六百萬人的印加，並且當時皮薩羅已經56歲了。遠征隊於1535年從巴拿馬出發，1537年皮薩羅登上了秘魯海岸，他隻帶了177人和62匹馬向內陸推進，進入了印加人的一個重要城市——卡哈馬城。當時印加帝國內部剛剛進行過一次大規模的內部爭奪皇權的鬥爭，國勢很弱，新登位的國王阿塔華爾帕十分懼怕皮薩羅，不敢采取積極抵抗的態度，阿塔華爾帕留下了大部隊，率領手無寸鐵的五千侍從同皮薩羅談判。皮薩羅命令部隊發動進攻，這實際上是一場大屠殺，西班牙不損一兵一卒，而印加的士兵幾乎全軍覆滅。這樣皮薩羅很順利地打開了進入印加帝國首府的北門，控製了印加君主，開始實現他的黃金夢。
皮薩羅攻入卡哈馬城後，把阿塔華爾帕軟禁起來，這是他從科爾特斯那裏學到的經驗。他的戰略正確無比，印加帝國實行中央高度集權製，所有的權力來自印加皇帝，在印加人的心目中，皇帝不是人而是神。皮薩羅控製了印加王，就等於控製了整個印加帝國。由於國王被囚，印加人失去了精神支柱也就沒有力量對西班牙人的入侵作出反應。皮薩羅把印加王囚禁在一所長22英尺，寬17英尺，高9英尺的石室裏。印加王知道西班牙人想要的隻是黃金，因此他對皮薩羅許諾，給皮薩羅以充滿關押他的石室那麼多的黃金，惟一的條件就是釋放其本人。皮薩羅欣喜若狂，並且主動打開印加國王的鐐銬，但是忠於諾言的印加皇帝認為隻有贖金交齊才能解下鐐銬，自己又主動帶上，善良的印加王並不知道，對於殖民者而言諾言是毫無意義的。印加人為了贖回他們的國王，從全國各地拿來了黃金，來填充石室。然而當贖金齊了後，皮薩羅卻失言，於是印加國王繼續被囚禁。不久，皮薩羅又自設法庭，把阿塔華爾帕送上了斷頭台，除去了後患，這樣皮薩羅成了印加的真正統治者。阿塔華爾帕的死，也預示著印加帝國的滅亡。
1533年11月，皮薩羅開進印加首都庫斯科，印加人未作任何反抗。不久皮薩羅模仿科爾特斯立一個新的印加皇帝做傀儡，利用這個傀儡，皮薩羅開始實現他的黃金夢。西班牙人洗劫了皇宮、神廟、花園和一切公共建築，隻要是稍微貴重一些的物品都被掠奪，印加人大批逃亡。皮薩羅把掠奪的黃金，五分之一送給西班牙國王，五分之四同他的部屬瓜分了。印加入的文明中心——庫斯科被破壞得不堪入目。1535年皮薩羅放棄了被毀壞的庫斯科，創立了利馬市，該市成了日後秘魯的新都。
迪戈·德·阿爾瑪格是皮薩羅的一個親密的同事。他曾經大力支持皮薩羅的探險，給皮薩羅很大的幫助。但是在瘋狂的掠奪過程中，他認為皮薩羅分給他的戰利品太少，極不公平，他多次要求皮薩羅重新分配，但是皮薩羅野蠻地拒絕了，因此阿爾瑪格懷恨在心。1537年阿爾瑪格率領他的一部分支持者發動叛亂，但皮薩羅早有準備，很快平息了叛亂，阿爾瑪格被捕獲，並被處死刑。皮薩羅認為問題已經解決，因此對叛亂的殘餘並沒有深究，這就留下了致命的禍根。1541年，在皮薩羅占領庫斯科的第8年，阿爾瑪格的一夥死黨暗殺了這位66歲的殖民領袖。
在殖民史上，皮薩羅是殘忍的代表，但是他的殘忍性格並不影響他偉大的軍事功績。皮薩羅創造的以少勝多的例子在軍事史上是極為引人矚目的。皮薩羅以180人的力量，成功地征服了有600多萬人口的印加帝國，這在曆史上是最驚人的軍事功績。而從作戰條件來分析，西班牙人的火器是並沒占絕對優勢的火繩槍裝火藥費時，實際上並不如弓箭好用，尤其是在秘魯的山地、叢林中；更何況皮薩羅剛進入卡哈馬卡時，隻有3人有火繩槍，不到20人有火器。西班牙人的勝利主要是靠指揮和決心，而不是常人所說的武器。當然皮薩羅也遇到不少好運氣，但皮薩羅在軍事指揮上的重要作用不能因為他是一個殖民者而加以否定。
皮薩羅征服了印加帝國後，在征服地區強行推行西班牙的宗教文化，這些地區至今的官方語言還是西班牙語，並保留著大量的西班牙文化。印加帝國崩潰後，南美洲也沒有任何地方取得反歐洲征服的勝利，數百萬印第安人仍然生活在南美洲。南美洲大陸的大部分地區印第安人從未得到過政權，歐洲的宗教和語言一直占著主導地位，可見皮薩羅這次遠征意義深遠。
皮薩羅的一生反映了西班牙對拉丁美洲進行殖民統治的過程，皮薩羅本人也是一個典型的殖民者的代表。對於這個改變曆史進程的西班牙人，後世的評價也褒貶不一，但是有一點是公認的：皮薩羅的遠征是當時曆史的產物，皮薩羅是改變印第安人曆史的人物。