一、黃酮類化合物的提取分離
(一)溶劑萃取法
黃酮類化合物的提取,需要考慮到原料、被提取物以及雜質的性質等因素。在植物體內的不同部位,黃酮類化合物結合的狀態會有所不同。在花、葉、果等組織中,黃酮類化合物是以苷的形式存在,一般可用甲醇、乙醇、水、丙酮或某些極性較大的混合溶劑進行提取;在木部的堅硬組織中,黃酮類化合物多以遊離苷元的形式存在,一般可用乙酸乙酯、乙醚和氯仿,甚至苯來提取。
用甲醇或乙醇為溶劑,在大多數情況下,都可以從植物原料中提取出黃酮類物質。90%~95%濃度的醇適宜於提取苷元,60%濃度的醇適宜於提取苷類。通常,水、堿液、乙醇溶液等適用於極性較大、水溶性基團占優勢的黃酮類物質,丙酮,乙酸乙酯等適用於極性小、脂溶性基團占優勢的黃酮類物質。
為了減少對黃酮苷精製的幹擾,需要除去葉綠素等雜質。葉綠素是植物中普遍存在的綠色色素,葉中含量最高,能溶於一般有機溶劑,較難溶於水。用水提取時,水提取液中的葉綠素可用苯或氯仿抽提除去。如用酒精提取,酒精濃縮液加水,放置冰箱,葉綠素常可沉澱出來。如果葉綠素不能析出,可用苯或汽油抽提除去。如果生物堿與葉綠素共存,可用酸水處理,生物堿可溶入酸水,葉綠素不溶。用鉛鹽法也可除去葉綠素。葉綠素能溶於堿水,有時可用堿水處理,除去葉綠素。但這隻是有效成分不溶於堿或對堿穩定時才能采用。
若原料中含有油脂、蠟和樹脂時,一般在提取之前,先用石油醚和苯提取,把這些物質除去。也可直接用酒精提取,提取液蒸去大部分酒精後用石油醚或苯抽提可除去油脂和蠟等。
若原料中含有大量蛋白質時,會影響提取物的形態穩定。用有機溶劑提取時,蛋白質不會被提出。用水提取時,蛋白質可以用酒精或甲醇沉澱除去,或者水提液加熱煮沸,使蛋白質變性沉澱出來,也可用鉛鹽除去。
用有機溶劑提取時,無機鹽一般不會被提出來,但有些無機鹽如硝酸鉀能溶於甲醇或乙醇。少量無機鹽一般不影響分離。無機鹽含量較大時,一般可將水提液蒸幹,加無水酒精或甲醇提取有機成分。如果有效成分溶於水而不溶於酒精時就不能用這種方法。如果有效成分溶於乙酸乙酯、氯仿等,則可用它們來萃取水溶液,無機鹽則留在水液中。
植物中含有大量的糖和澱粉,在用水提取時,水提液中會混有大量的糖和澱粉,此時可將水溶液蒸幹,再用無水酒精處理,糖和澱粉不溶,可沉澱後除去。若有效成分溶於乙酸乙酯、氯仿等,則可用它們萃取水溶液,將有效成分提出。用有機溶劑提取時,澱粉不會被提出,用丙酮、甲醇、乙醇等極性溶劑提取時,有時會帶出少量糖分。
另外,植物中的鞣質對黃酮苷的提取也會有較大的影響。鞣質是一種有澀味的、能與生物堿和蛋白質產生水不溶性沉澱的多酚類化合物,它能溶於水和酒精,不溶於苯、氯仿等有機溶劑,因此水或酒精提取液中常雜有大量的鞣質。去除鞣質有幾條途徑:
(1)明膠沉澱法在樣品水溶液中加4%明膠水溶液,至沉澱完全,過濾,濾液減壓濃縮後,加入3~5倍酒精,使過量明膠沉澱,然後過濾除去沉澱。如果明膠尚未除盡,可將濾液濃縮後,再用酒精沉澱一次。也可以將加明膠沉澱後的混懸液,置於水浴上加熱,不斷攪拌,沉澱逐步凝結,將上清液傾出,減壓濃縮,再按前述方法除去過量明膠。
(2)生物堿沉澱法常用生物堿是咖啡堿,其他生物堿及吡啶也可用。在樣品水溶液加入1.5%咖啡堿水溶液至沉澱完全,過濾,濾液用氯仿振搖,除去過量的咖啡堿後即可得到除去鞣質的水溶液。