七、煙葉在烘烤過程中的酶促棕色化反應
煙葉在烘烤過程中不適宜的條件導致顏色由黃色逐漸變深最終呈棕色或褐色，稱為棕色化反應。棕色化反應是一個複雜的生理生化過程，包括酶促棕色化和上述的非酶棕色化兩種類型。
酶促棕色化反應主要指煙葉在變黃末期和定色階段，由於葉內氧化酶（特別是多酚氧化酶）活性增強，物質的氧化還原平衡被破壞，細胞中的多酚類物質被氧化而不能被還原，葉內深色物質積累，煙葉顏色加深的過程。其實質在於煙葉中含有許多酚類物質，如咖啡酸、綠原酸、芸香苷等，及某些自身為黃色的黃酮類物質在變黃過程中轉化為多酚類物質，經過氧化可產生淡紅色至黑褐色的醌類物質。煙葉中醌類物質積累和縮合的結果導致了煙葉由黃色轉變為不同程度的褐色。在變黃階段，細胞仍處於有生命狀態，氧化-還原作用亦能保持平衡，多酚氧化酶作用於多酚類物質使其氧化成為醌，同時也能使醌還原為多酚，因此醌類物質不積累，所以顏色不發生變化。而且，在此期間，活細胞中多酚氧化酶與咖啡酸、綠原酸等作用底物各位於一定的區隔，二者不容易接觸，因此棕色化反應也就不易進行。但是，由變黃階段轉入定色階段，葉組織逐漸死亡，原生質結構開始自溶和解體，若升溫過高而葉水分的排出不協調，高溫對細胞的傷害將致使煙葉中水分強行排出，細胞汁液外滲，促進氧化酶的活性，棕色化反應加速進行，煙葉將成為褐色或深褐色。若升溫過遲，則煙葉中養分消耗過多，特別是糖類消耗過度，因供氧不足而使醌類物質的還原受阻，最終使煙葉變為不同程度的褐色。一方麵細胞膜透性增大，部分物質由細胞內向外滲出進入細胞間隙，原子氧自由進入葉組織，激發了多酚氧化酶的活性，創造了良好的氧化條件；另一方麵由於細胞內區隔被破壞，原來束縛於液泡中的氧化酶類得以與多酚類物質（兒茶酚、單寧酸、酪氨酸等）接觸，從而使多酚類物質迅速氧化形成醌類物質，並大量積累，聚合成為大分子深色物質，煙葉就呈現出顏色深淺不同的雜色，煙葉品質也因此而降低。
據報道，煙葉中多酚物質含量一般為1.8%～5.2%，酚類物質含量與變黃時間直接相關。煙葉一旦顏色變褐，多酚類物質含量就減少85%以上。棕色化反應往往發生在變黃時間過長或定色過於遲緩的情況下，這一方麵是由於有良好的氧化條件，另一方麵，也與糖分消耗過多，使葡萄糖提供氫將醌還原的能力降低有關，結果導致醌類物質積累，為煙葉棕色化奠定了物質基礎。還有研究報道，烤後煙葉呈棕紅色是綠原酸氧化後與去甲基煙堿、氨基酸類物質作用所形成的，因而去甲基煙堿是對煙葉質量起不良作用的成分，它含量高時將使煙葉在烘烤中不容易定色。
棕色化反應的產物是十分複雜的。多酚氧化物能與氨基酸、糖類及礦物質等化合，形成多種分子量大小不等、顏色各異的複合色素。這些複合色素顏色的深淺與其分子量大小有著密切的關係，分子量越大、顏色越深；分子量越小、顏色越淺。目前已從煙葉中鑒定出一種鐵、蛋白質、綠原酸-芸香苷複合物的深棕色色素，綠原酸在煙葉調製過程中的變化量很大。在調製的煙葉中咖啡酸含量不超過幹重的0.05%，莨菪甙及其葡萄糖甙較鮮煙葉中有所升高，其含量約占幹重的0.03%，如果調製時煙葉發生了棕色化反應之後，使多酚類物質在很短時間裏就會減少85%，其原因主要是多酚氧化酶綠原酸作用的結果。烤煙煙葉綠原酸和芸香苷在調製期間分別增加40%以上，這對於改進煙葉香吃味將是有利的。
不同素質鮮煙葉中多酚氧化酶活性有很大差異，但均隨著煙葉成熟度的提高呈下降的趨勢。據測定，中等肥水條件下正常落黃成熟的鮮煙葉中，多酚氧化酶活性較低，常在0.2維生素Cmg(min·g·FW)以下，烘烤質量較好；在高肥水條件下形成的葉片肥大、水分含量高的煙葉以及非正常落黃的煙葉當中，多酚氧化酶活性往往較高，一般都在0.3維生素Cmg(min·g·FW)以上，黑暴煙甚至高達0.4維生素Cmg(min·g·FW），其烘烤質量較差。此外，煙株的留葉數增加，葉內多酚氧化酶活性有所增強，且葉位越高，酶活性越強，上二棚葉高於腰葉；感染煙草普通花葉病（TMV）的煙葉內多酚氧化酶活性顯著增強。
據韓錦峰等研究：田間生長狀態的鮮煙葉中多酚氧化酶活性最高，在烘烤過程中多酚氧化酶活性發生變化，而且因環境溫濕度條件有很大差異。宮長榮等研究結果表明：總酚含量在烘烤開始後的前24h呈增加趨勢，之後則降低，至72h降到最低，72h後又迅速升高直到烘烤結束；綠原酸含量在烘烤0～24h也呈上升趨勢，其最低值出現在60h或72h處，之後則緩慢上升至烘烤結束；芸香苷含量隨烘烤進程的推進，呈遞增趨勢，中間稍有起伏；多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)活性變化趨勢相反。在烘烤過程中芸香苷的含量變化與總糖含量呈極顯著正相關（r=0.822**），與澱粉、煙堿和蛋白質含量呈極顯著負相關。
在環境溫度40℃以下多酚氧化酶活性較高且相當穩定，當溫度達到55℃以上時，就會迅速鈍化失去活性。正常烘烤條件下，在變黃階段和定色階段，隨著溫度的上升，煙葉失水量增加，多酚氧化酶的熱穩定性逐漸降低。隨著時間的推移，當幹球溫度達到47～49℃變至全黃時，若煙葉失水量超過50%左右表現為小打筒時，多酚氧化酶活性就受到抑製而變得很微弱，煙葉的黃色能夠順利固定下來。整個過程多酚氧化酶活性呈現出平滑下降的曲線。若在此期間，環境溫度上升過快，引起多酚氧化酶過早失去活性，幹燥速度快於變黃速度，易形成大量青煙或黃中帶青現象；若在低溫下煙葉變黃充分而失水量小（不超過50%），不發軟塌架（即通常所講的硬變黃），隨著升溫達到45～47℃，多酚氧化酶活性都會出現一個或高或低的上升高峰，酶活性的大大增強，最終將導致煙葉棕化變褐。
烘烤環境條件有誘導棕色化反應發生作用。一般情況下，煙葉完全變黃以前變為棕色是很少見的，但煙葉在變黃後再加熱可以誘導棕色化反應的發生。研究發現：煙葉烘烤環境溫度低於44℃條件下，煙葉變褐速度極為緩慢，表現並不明顯，當溫度升高到57℃，煙葉變褐的速度很快，僅6min煙葉即可完全褐化變為棕色。約翰遜和威克斯采用遠紅外加熱的處理方式，使變黃後的煙葉在15s內溫度驟然升高到80℃，經極短時間（15~20s）之後，煙葉開始變為褐色，接著使葉溫降至25℃，保持25min時間，煙葉顏色變化不是一條直線，在降溫後的前8min，顏色值變化極快，8min以後變化速度很慢。這種顏色值的變化是由驟然加熱誘導了棕色化反應發生所引起的。
誘導煙葉發生酶促棕色化反應主要有兩個外部因素，一個是烘烤環境溫度，另一個是相對濕度，兩者結合影響煙葉含水量和葉內酶的活性，從而製約棕色化反應的發生。正常情況下的煙葉，在45~46℃時，環境相對濕度60%以上，煙葉失水量少於50%將導致棕色化反應的發生；但是，即使鮮煙葉水分較高，在此溫度範圍內，隻要環境相對濕度在60%以下，煙葉在變黃末期的失水量大於50%，則棕色化反應就不容易發生。甚至多酚氧化酶活性較高的鮮煙葉，如果能在變黃過程失水達到凋萎狀態，定色階段煙葉含水量和環境相對濕度低，多酚氧化酶活性隨烘烤時間延長而下降，不表現升高，烤後煙葉不至於變褐。所以，變黃階段煙葉的失水和變黃必須能夠同步進行，變黃後煙葉呈凋萎發軟狀態，然後再升溫定色，多酚氧化酶活性逐漸下降。對於含水量較高的煙葉，在煙葉變黃後失水能夠達到60%以上，多酚氧化酶的活性也會得到控製。第三節煙葉烘烤環境條件對品質形成的影響煙葉烘烤變黃和定色階段的溫濕度條件對葉組織內代謝活動的影響，導致了煙葉化學組成、內在和外觀質量都有所不同。