美國和英國的製藥公司都不願意使用發酵的方法（用微生物在合適的培養基中令其生長並產生新的物質，這種方法通常稱為發酵）來生產青黴素，因為需要很大的設備，占很大的麵積，產量也不高。他們根據維生素類用化學合成方法比從天然物中提取分離要便宜得多的經驗，打算用化學合成方法生產青黴素。要合成青黴素首先必須知道它的化學結構，於是人們開展了對青黴素化學結構的研究。
青黴素化學結構的研究工作由英國的魯賓遜和亞當斯負責領導，他們兩人在當時均可稱為有機化學大師。研究中，英國的青黴素化學委員會和美國的醫學研究委員會也交換信息，但是有關青黴素的化學性質等問題仍屬軍事機密。
首先出現的問題是青黴素的純度隻有50％，大量雜質會影響結構的測定。1943年夏天，美國的施貴寶公司發現可以用重結晶法精製。第二個出現的問題，是英國得到的青黴素純品與美國得到的不同。由此才認識到，青黴菌品種的不同產生的青黴素各種衍生物的比例也不同。進一步研究又發現，已經認為是純品的青黴素其實仍然是混合物，需要進一步分離提純。
青黴素的化學結構，經過兩國有機化學家的研究，到1943年底認為有兩種最可能的結構：一種是一個噁唑酮環通過一個碳原子與一個氫化噻唑環相連，另一種是一個四元的β-內酰胺環通過兩個原子與氫化噻唑環並合。當時是使用化學降解方法測定化學結構。由於青黴素的化學性質很不穩定，結構很容易發生變化，因此哪個結構是正確的，難於分辨。
到1945年，由X光結晶學的研究證明青黴素的結構為結構2，是一個含有四元β-內酰胺環的化合物。四元環的環張力大，與五元的氫化噻唑環並合更增加了不穩定性，很容易開環而失去抗菌作用。在酸、堿性介質中更易水解開環。結構1就是結構2的水解重排產物。在確定了青黴素主核的化學結構後，側鏈的結構就容易確定了。由此證明，英國分離出的純青黴素為苄基青黴素，後定名為青黴素G；美國分離出的純青黴素為2-戊烯酰基青黴素，後定名為青黴素F。另外又分離出5種青黴素，都是側鏈不同的結構，分別定名為V、O、S、X和K。這7種青黴素是青黴菌發酵過程中產生的主要成分，其中以青黴素G的抗菌作用最強。為了獲得主要為青黴素G的產品，發現在發酵中加入苯乙酸或苯乙酰胺即可得到青黴素G占絕對多數的產品。我們把加入的苯乙酸或苯乙酰胺稱作“前體”。
在了解到青黴素的化學結構和其不穩定性後，各製藥公司便都放棄了化學合成的想法，繼續用發酵方法生產青黴素。到1957年，美國麻省理工學院的希漢教授終於實現了用化學合成方法合成青黴素V。但由於反應步驟多，反應條件苛刻，且收率隻有1％，則其成本根本無法與發酵法相抗衡，以後雖沒能用於青黴素的生產，但在學術上是有很高價值的。