1935年，當德國的杜馬克在英國皇家學會報告他們發現的磺胺藥物的研究工作時，在聽眾中有一位長著一頭灰發的微生物學家，名叫弗萊明（1881～1955年）。他那時已經發現了一種比磺胺類藥物更好的抗生素——青黴素，隻是當時醫藥界的興奮點都集中在磺胺類藥物上麵，而未引起注意。
弗萊明發現青黴素是偶然的，但含有必然的因素。
弗萊明是蘇格蘭人，1906年畢業於英國的聖瑪麗醫學院，曾作為醫官服役於前線。他看到大批的戰士死於傷口感染，便下決心尋找能夠抑製傷口感染的藥物。戰後他回到聖瑪麗醫院工作，1922年他發現，人的眼淚和唾液中有一種能殺滅細菌的物質，他稱之為溶菌酶。從此便集中精力研究溶菌酶對各種細菌的作用，以便用於傷口的消毒。他用瓊脂平皿培養各種細菌，在接種細菌時打開平皿的蓋，空氣中的黴菌就可能落到平皿內，特別是弗萊明實驗室的樓下是培養黴菌的，用於製作對過敏症有效的疫苗，落入黴菌的機會就更多了。1928年6月，弗萊明和助手在接種完細菌後就開始休假，他們沒有把培養皿放在37℃的溫箱中，而是放在了實驗台上。事有湊巧，那幾天的氣溫較低，適合於青黴素的生長，於是落入的一種青黴菌便生長成綠色的菌落，而接種的葡萄球菌和其他的細菌沒有生長。幾天以後，氣溫升高，細菌開始生長，但青黴菌周圍的葡萄球菌受到抑製沒有生長，剛好與平皿其他部分生長旺盛的葡萄球菌的菌落形成鮮明的對照。9月3日弗萊明和助手回來以後，助手看到平皿被黴菌汙染就要把它們處理掉，重新開始實驗。可是弗萊明一眼就看見了這個平皿中，長著大的綠色菌落的周圍沒有生長白色的葡萄球菌，而遠一些的地方白色菌落茂密。他感到很奇怪，就把它拍了照片，並取出了一點青黴菌，用甲醛蒸氣處理，以便保存。起初弗萊明認為綠色的青黴菌產生了溶菌酶，把周圍的細菌溶解了。他讓助手把這種青黴菌繼續培養，使菌種進一步純化，然後大量地培養，以便分離溶菌酶，研究它的使用方法。他給這種“溶菌酶”命名為青黴素。兩名助手設計了扁平的玻璃瓶子，使用液體培養基，將瓶子平放著，以便培養基接觸空氣的麵積大一些（青黴菌生長需要氧氣）。待青黴菌生長多了以後，他們做了試驗，證明被稱為青黴素的物質是在溶液裏而不是在菌落裏。於是他們把黴菌濾掉，把濾液調成微酸性，在40℃減壓濃縮。這是因為他們發現，若在微堿性或高溫下，青黴素都會被破壞。待濃縮為粘稠狀液體後加入酒精，便出現很多的沉澱。經過試驗證明，酒精溶液的殺菌作用很強，而沉澱無效。因為溶菌酶是蛋白質，而蛋白質是可以被酒精沉澱出來的，這樣就排除了有效成分是溶菌酶的可能性。可是他們發現酒精溶液的殺菌作用逐漸地減弱，幾周後就完全消失了，說明這種溶於酒精的物質很不穩定。這使弗萊明感到氣餒，因為不大可能用它做治療藥物。於是1929年，弗萊明發表了一篇文章，指出青黴菌可以產生一種有殺菌作用的青黴素。此後，弗萊明雖然仍繼續研究青黴素的分離和性質等問題，但沒有明顯的進展，因為當時的化學手段，還沒有發展到足以解決青黴素結構問題的程度。
出乎意料的是弗萊明的文章並未引起醫藥界的注意，其原因大概是當時大家的注意力集中在尋找化學合成的殺菌劑方麵，認為青黴素沒有實用的意義。青黴素研究的擱淺，為磺胺類藥物的發展提供了條件。
牛津的一所病理學院主任，澳大利亞籍的弗洛瑞對溶菌酶很感興趣，在這方麵進行了廣泛的研究。1938年的夏天，他的助手，一名從希特勒德國逃出的青年猶太難民錢恩，在文獻中發現了1929年弗萊明發表的關於青黴素的文章，經弗洛瑞同意，他決定對青黴素進行深入的研究。錢恩發現，青黴素可以用有機溶劑從黴菌的培養液中提取出來。從這種性質看，他感到青黴素不大可能是一種酶，而是小分子化合物。但他也遇到了同樣的麻煩，青黴素的性質很不穩定，不容易從溶液中得到。但這並沒有使他氣餒，而是更引起了他的研究興趣。
第二次世界大戰爆發後，需要大量和多種的殺菌消炎藥物，特別是在有膿血存在下仍有殺菌作用的藥物，而磺胺類藥物在這種情況下是無效的。青黴素在有膿血存在下，仍有殺菌作用，因此它成為深入研究的對象。錢恩從醫學研究委員會和洛克菲勒基金會得到資助。在弗洛瑞的指導下，整個病理學院都投入到對青黴素的研究中，使研究的步伐加快了。
為了能得到更多的青黴素，他們加大了培養量，並用圓柱形的大瓶子進行培養。然而結果是，青黴素的生成量並沒有增加多少。後來，他們發現培養液在1.5 cm的深度時，青黴素的生成量最多，培養液太深反而不行，因為青黴菌的生長需要氧氣。這樣他們就把瓶子橫放著來培養，可是瓶子是圓柱形的，橫放著要滾動，同時這種圓柱形的瓶子，放1.5 cm深的培養液，有效體積太小了，於是又改成扁平的瓶子。最後，他們設計了一種陶瓷的、像醫院病人在病床上使用的便盆樣子的培養器皿。錢恩等人在研究中發現，可以用極弱的堿性水溶液將青黴素從乙醚溶液中提取出來。這樣，就可以用比乙醚液體積小得多的微堿性水溶液把青黴素從乙醚液中提取出來，達到濃縮的目的。他們設計了機械的逆流提取設備，那是一根比較粗的，兩端密封的玻璃管，在兩端各有兩個側管，讓經過濾除青黴菌並酸化後的培養液從玻璃管上端的一個側管向下流，同時讓乙醚自玻璃管下端的一個側管向上流動，兩種液體在玻璃管中混合。因為乙醚的相對密度比水輕許多，所以青黴素被乙醚提取後，便隨乙醚液從玻璃管上端的另一側管流出來。然後還是用這種設備，讓微堿性的水溶液從玻璃管上端的一個側管向下流，同時讓提取了青黴素的乙醚液從玻璃管下端的一個側管向上流。這樣青黴素就從乙醚中轉移到微堿性的水溶液中。但是，錢恩等人沒有辦法把極不穩定的青黴素從水溶液中分離出來。後來他試用了1935年瑞典人發明的冷凍幹燥法。此法是將水溶液在低溫下冷凍結冰，然後在冷凍及高真空下使水在固體狀態下升華，溶液中的固體就剩餘在容器中。這樣他們就把微堿性青黴素水溶液濃縮為棕色粉末。青黴素在非常低的溫度下，沒有被分解破壞。他們對這種棕色粉末的效價進行測定，1mg棕色粉末相當於5個牛津單位（這是他們自己製定的效價單位。他們把1mL培養液中的青黴素用鏈球菌做試驗，把對它的抑菌能力定為1個牛津單位）。