到1940年3月，他們一共得到了100mg棕色粉末，弗洛瑞用這些樣品做了藥理和毒性試驗。他孤注一擲地把這100mg棕色粉末分成兩份，注射到兩隻正常小白鼠體內，沒有發現任何反應，說明這棕色粉末沒有毒性。1940年5月25日上午11點，弗洛瑞又得到錢恩等人分離出的100 mg棕色固體。他用8隻小鼠做實驗，先在這些小鼠體內注射進致死量的鏈球菌。1小時後給兩隻小鼠分別注射10mg棕色粉末，給另兩隻小鼠分別注射5mg棕色粉末，剩下的4隻小鼠不注射棕色粉末，作為對照。注射了5mg的兩隻小鼠，在10小時內又分別注射了4次5mg的劑量，則一共用去了70mg樣品。弗洛瑞的一名助手在實驗室守候觀察。到夜裏，對照組的小鼠全都死了。兩天以後，有一隻隻注射了10mg棕色粉末的小鼠也死了。剩下的3隻小鼠都存活了下來，這使他們非常興奮。這個結果說明含青黴素的棕色固體是有效的，而且證明它就是在體內有效的物質，因為在以前做的實驗，都是體外的抑菌試驗或是在皮膚表麵的試驗。於是他們立即著手進行更廣泛的生物活性實驗工作。同年6月，實驗又證明青黴素對葡萄球菌也有很強的殺滅作用，到8月，他們把結果在期刊上發表。10天後弗萊明訪問了這個研究組，弗洛瑞感到很失望，因為這是自發表文章以後得到的惟一響應。他去拜訪了英國的幾家大的製藥公司，希望得到他們的支持，可惜的是這些公司都在為支援反希特勒的戰爭提供前線需要的藥品，沒有能力再做這種工作。在英國派到法國的遠征軍從法國撤退以後，希特勒侵犯英國是不可避免的了。弗洛瑞感到，若戰爭接近牛津，他們的研究結果將全部被毀滅。於是他決定將青黴菌的孢子塗在當時所有一同工作的人的大衣裏麵，如果他們之中有任何一個人能夠逃脫出去，還可以在別處繼續進行研究。1941年1月，他們擴大了製作青黴素的規模，以便積累足夠的量來進行臨床試驗和結構測定工作。他們在製作和提純青黴素方麵也有了突破，使用了一種稱為吸附層析法的方法。該方法是把氧化鋁裝在一根粗一些的玻璃管內，直立放置，然後把青黴素的溶液從玻璃管上端傾入，液體經由氧化鋁流下來，青黴素被吸附在氧化鋁上，雜質留在流下來的溶液中，然後用合適的溶劑從氧化鋁上把吸附的青黴素溶解下來。經過這樣精製的青黴素，可以達到50牛津單位/mg。用這種方法精製的青黴素，經兔子試驗發現有熱源，如果再一次用吸附層析法精製，熱源就不存在了。
實驗證明青黴素可以被酸破壞，因此不能通過口服給藥，因為胃液是強酸性的，所以隻能經注射給藥。但是如果一次注射大劑量的青黴素，則大部分的青黴素很快經由腎髒從尿中排泄，所以隻能是給病人從靜脈點滴給藥。這就是把青黴素溶於水中放在一個瓶子裏，把瓶子倒掛在比病人躺著的位置要高大約1m的高度上，瓶口塞子上紮進一個注射用的針頭，針頭的一端用橡皮管和另一個注射針頭相連，將這個針頭紮入病人的靜脈中，由一個螺旋夾子調節藥品溶液的滴入速度，使用前針頭和皮管都需要經過消毒以免相互傳染。這樣，可使青黴素在較長時間內在人體中維持殺菌的水平。也可采用一天注射多次的辦法。