1941年2月，他們開始了第一例臨床試驗，病人是一位警察，感染了鏈球菌和葡萄球菌，瀕臨死亡。第一次給他靜脈滴注200 mg青黴素，然後每3小時再注射100 mg，連續5天，病情得到了很大的改善。可是這時，他們製備出的青黴素已經用完，於是他們把從病人尿中回收的青黴素也給病人用了，又持續注射了3天，病人幾乎痊愈。病人的良好狀態維持了10天，後來因體內殘留的細菌引起的肺部感染，導致病人死亡。這是非常遺憾的事，如果他們能夠有更多的青黴素，繼續給病人注射幾天，將體內的細菌全部殺死，病人就可痊愈。這個臨床結果，證明青黴素是很有效的抗菌藥物。他們吸取了這次的慘痛教訓，準備了足夠量的青黴素後又開始了3例臨床試驗。其中1例是一個小孩，這個小孩因腦部嚴重受傷引起眼後感染。給他用青黴素治療後眼部感染痊愈，但腦部的嚴重損傷導致了小孩的死亡。其他兩例均為嚴重感染的病人，經青黴素治療後都痊愈了。1941年8月，他們發表了臨床試驗的報告。
英國在反法西斯的戰爭中已無力發展新藥，而弗洛瑞的病理學院是不可能進行青黴素的大規模生產的。於是弗洛瑞和一名助手，在1941年6月到美國去尋求幫助。美國當時尚未參加第二次世界大戰。弗洛瑞找到在美國農業部工作的一位朋友求教，他朋友認為，大規模生產青黴素隻能像做啤酒一樣用深的大罐來培養，像他們用1.5cm深的培養液來培養是不可能進行大規模生產的，因為沒有這麼大的地方放這些培養器皿。於是他們被介紹到伊利諾州的北方農業研究所去，那裏有豐富的深罐培養經驗。弗洛瑞的助手留在那裏，把他們帶去的黴菌孢子用深罐培養。他們在培養基中加入玉米漿，使青黴素的產量提高了12倍。後來他們發現，嚴格控製培養過程的pH值對於提高青黴素的產量非常重要。
弗洛瑞在美國醫學研究委員會的朋友，為弗洛瑞安排了一次與製藥公司會麵的會議。弗洛瑞報告了青黴素的研究情況和結果，有兩家公司願意參加這項工作。會上達成協議：生產出的青黴素都統一由醫學研究委員會安排臨床試驗，同時決定把青黴素作為一種軍事秘密，不公開名稱。他們均采用深罐培養法。與此同時，北方農業研究所致力於發現能產生高產量青黴素的黴菌。他們發現了一種長在市場上出售的羅馬甜瓜上的綠色青黴菌能產生較高產量的青黴素。美國北方的幾所大學也參與了這項工作。威斯康星大學的微生物學家用X光照射青黴菌，以引起它的突變，結果發現，可以在每毫升培養液中含有500單位青黴素的菌種，而弗洛瑞帶來的青黴菌隻能產生1個單位。後來他們又使突變的菌種產生青黴素的單位提高到900。在美國醫學研究委員會安排下，對1942年11月在波士頓一個夜總會的火災中嚴重燒傷並已感染的220名病人，進行了臨床試驗，取得了很好的效果。到1943年前5個月，一共生產了4億單位青黴素，後7個月又使產量達到200億單位。到1944年1月，輝瑞公司一個月就生產了1000億單位，成為世界上生產青黴素最多的製藥公司。這時生產的青黴素已經能完全滿足戰爭的需要。
在英國，青黴素的研究也在繼續進行，不過他們仍保守地采用表麵培養，像培養蘑菇一樣，產量很低。後來在英國供應部主持下成立了青黴素化學委員會，英國的幾家製藥公司參加了這個委員會並參與了青黴素的生產。青黴素化學委員會與美國醫學研究委員會，不定期地交流臨床試驗信息。1943年3月，在牛津進行了大規模的臨床試驗，共有187位病人；但是因為青黴素的產量低，隻能保證17人靜脈滴注給藥，其餘的人隻能外用。兩種生產方法和研究方法的差別就明顯地表現出來。當時雖然英美是同盟國，但資本主義製度使生產的秘密仍不能相互傳遞。
青黴素的優良殺菌作用和低毒性，使其在第二次世界大戰的後期發揮了極其重要的作用。盡管有很多種磺胺類藥物可供使用，但青黴素的出現，使磺胺類藥物的重要性開始下降。青黴素得以發展成為藥用，也是多學科相互配合取得的成果。