1929年，湯飛凡回到祖國，擔任上海中央大學醫學院和雷氏德醫學研究院教授，兼細菌學係主任。那時候，祖國的微生物科學，簡直還是一片荒野，要做的工作很多很多，選擇什麼研究課題為祖國和人民服務呢？經過再三考慮，他決定集中精力，研究沙眼病原。
沙眼是結膜的一種傳染性眼病。臨床表現為怕光、疼痛、分泌很多的眼淚。患這種眼病很痛苦，嚴重的時候還會造成失明。沙眼的病原是什麼呢？這是各國醫學界都在關心和研究的課題。湯飛凡讀過大量的醫學著作和研究論文，熟悉沙眼病原研究的曆史：在微生物學開創時期，人們就很重視沙眼病原的研究。19世紀末，德國科學家、微生物學創始人之一科赫提出了沙眼的“細菌病原說”。20世紀20年代，法國學者證明沙眼材料經過砂棒過濾，除去細菌後仍能感染，推翻了“細菌病原說”，第一次提出了“病毒病原說”，但是沒有最後證實。1928年，日本學者從沙眼中分離出一種叫做“沙眼杆菌”的細菌，又重新提出了“細菌病原說”。
湯飛凡一邊教學，一邊進行研究和實驗。不久，寫出了第一篇研究論文，題目是《沙眼杆菌與沙眼之研究》。這篇論文用親身的實驗，推翻了錯誤的“細菌病原說”。為什麼沙眼病毒學說提出幾十年來，就沒有一個人能分離出一株沙眼病毒呢？有一天，湯飛凡突然想到一個新的線索：分離不出沙眼病毒，會不會是做試驗時使用了青黴素和鏈黴素的結果呢？
根據臨床經驗，青黴素可以抑製革蘭氏陽性細菌生長，鏈黴素可以抑製革蘭氏陰性細菌生長。病毒學家又都認為，各種病毒對所有抗菌素都不敏感。因此，那時國內外分離病毒有個常規，都要使用青黴素和鏈黴素。分離沙眼病毒也不例外。當把沙眼病人的結膜材料接種到雞胚上去時，也要加入青黴素和鏈黴素，為的是控製眼結膜裏夾雜的細菌感染。對這個常規，所有病毒學家都習以為常，從來沒有人懷疑過。但是，湯飛凡提出了問題：沙眼病毒是不是同其他病毒一樣，對抗菌素不敏感呢？有沒有可能沙眼病毒對抗菌素是敏感的，在做試驗的時候被青黴素、鏈黴素殺死了，所以分離不出病毒株來呢？
湯飛凡親自到醫院去了解青黴素、鏈黴素對治療沙眼的效果，到圖書館查閱中外文資料，掌握國內外臨床上應用青黴素、鏈黴素治療沙眼的情況。綜合大量調查，他得到一個初步的認識：鏈黴素對治療沙眼，基本上是無效的，說明它對沙眼病毒沒有傷害；青黴素對治療沙眼有無效果，說法不一，不能肯定。湯飛凡繼續進行更深入、更周密的調查研究。有一天，他終於從一本英文醫學著作《人的病毒病》中，查到一處有關青黴素與病毒的論述，其中指出：青黴素能控製沙眼症狀的發展。湯飛凡很高興，於是，他就把研究的重點，集中到了青黴素的使用上。
1956年6月12日，是個不平常的日子。這天一清早，湯飛凡和他的助手就來到了實驗室，他們要做一次與往常不同的分離沙眼病毒的實驗，就是設想以減少青黴素注入量，來取得沙眼病毒株。
實驗開始，湯飛凡熟練地將沙眼結膜材料進行接種，然後隻注入原用量1/5的青黴素，結果，第一株沙眼病毒被分離出來了！在場的人歡騰起來，向湯飛凡教授祝賀勝利。湯飛凡從興奮中立刻冷靜下來。心裏說：隻有一次成功，還不能排除其他偶然因素，而偶然性是不能成為科學的依據的。接著，他們又著手準備做一次新的實驗，完全不用青黴素，而把鏈黴素的用量增加一倍，看能不能再分離出沙眼病毒來。實驗又成功了。不久，他們又作了第三次、第四次實驗，沙眼病毒也都分離出來了。
湯飛凡的研究成果結束了半個世紀以來全世界科學家們對沙眼病毒的疑惑，至此，沙眼病原研究揭開了曆史性的一頁。世界各地紛紛來信來電，向湯飛凡表示祝賀和感謝。為了尊重湯飛凡為人類作出的貢獻，國際上把沙眼病毒稱為“湯氏病毒”。1970年，國際上將沙眼病毒和其他幾種介於病毒和細菌之間的、對抗菌素敏感的微生物命名為衣原體，湯飛凡被稱為“衣原體之父”。
目前已知的與人類疾病有關的衣原體有三種：鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體、肺炎衣原體。這三種衣原體均可引起肺部感染。鸚鵡熱衣原體可通過感染有該種衣原體的禽類，如鸚鵡、孔雀、雞、鴨、鴿等的組織、血液和糞便，以接觸和吸入的方式感染給人類。沙眼衣原體和肺炎衣原體主要在人類之間以呼吸道飛沫、母嬰接觸和性接觸等方式傳播。
萬嬰之母林巧稚