12月底，國民黨頑固派的反共活動不僅沒有收斂，反而日見囂張，已集中了12個師準備進攻華中新四軍。12月30日，中共中央召開政治局會議，毛澤東在會上指出：“目前時局還不能說反共高潮已開始下降”。第二天，毛澤東為中央書記處起草指示，除了命令江南部隊迅即北移、並從華北派遣一部兵力加強華中外，還要求所有華中及山東的黨和軍隊必須緊急動員起來，為堅持抗日根據地、打破頑固派進攻而奮鬥。
毛澤東最擔心的是皖南的情況，一再致電項英，催促北移，並在12月26日再次對項英提出了尖銳的批評。
與此同時，毛澤東為新四軍軍部的安全轉移做著最後的努力。12月27日，毛澤東一麵請周恩來繼續向蔣介石交涉，要他命令李品仙不得妨礙新四軍北移；一麵以朱德、葉挺的名義急電國民黨第五戰區司令長官李宗仁和副長官李品仙，懇請他們從抗戰的利益出發，不要妨礙新四軍的北移。
但是，這時的形勢已難以逆轉。顧祝同根據蔣介石將皖南新四軍“一網打盡，生擒葉項”的命令，已完成圍殲皖南新四軍的準備，震驚中外的皖南事變終於爆發了。
1941年1月4日，新四軍軍部及直屬部隊9000餘人遵令北移。由於項英的猶豫不決，行期一再延誤，國民黨已在新四軍行進的必經地區埋下重兵。6日，倉促行動的部隊到達涇縣茂林地區時，突然受到國民黨第33集團軍總司令上官雲相指揮的7個師8萬餘人的嚴密包圍和猛烈襲擊。雙方兵力懸殊，國民黨軍隊又已作了充分準備，新四軍陷入苦戰中。
7天7夜後，新四軍終於因彈盡糧絕而全軍覆沒。奉命同國民黨軍隊談判的軍長葉挺被扣；項英、袁國平、周子昆等遇難。1月15日，中共中央召開政治局會議，檢討新四軍失敗的原因，毛澤東指出：從我們自己方麵來說，首先是由於項英、袁國平等沒有反磨擦的思想準備，其次是指揮上的錯誤。他提出：袁、項的錯誤須立即宣布，如何處置交七大解決。會議通過了毛澤東起草的《中央關於項袁錯誤的決定》。在這次會上毛澤東提出：我們要實行全國的政治反攻，必須要像我們前次反對第一次反共高潮時一樣有非常強硬的態度，隻有不怕決裂，才能打退國民黨的進攻。他又說：左派主張我們馬上與國民黨大打起來，我們也不能實行這種政策。
1月17日，蔣介石發布取消新四軍的命令，把葉挺交付軍事法庭審判，將反共高潮推到頂點。國共關係已處於異常緊張的狀態。這時，毛澤東反而更加冷靜。他接受了劉少奇的建議，提出“在政治上取猛烈攻勢，而在軍事上暫時還隻能取守勢”。
1月20日，中共中央召開政治局會議，討論對付時局的辦法。毛澤東指出，要挽救時局，實現好轉，必須由國民黨當局取消1月17日的命令。會議決定：成立中央軍委主席團，由毛澤東、朱德、彭德懷、周恩來、王稼祥組成，軍委實際工作由主席團辦理。駐國民黨統治區的各辦事處實行撤退。
當天，根據政治局會議決定，在延安發布了毛澤東為中共中央革命軍事委員會起草的重建新四軍軍部的命令，任命陳毅為新四軍代理軍長，張雲逸為副軍長，劉少奇為政治委員，賴傳珠為參謀長，鄧子恢為政治部主任。隨後，新四軍軍部在蘇北鹽城成立，整編全軍為7個師和7個獨立旅，共9萬多人，在大江南北堅持敵後抗戰。
同時，也根據政治局會議的決定，毛澤東以中共中央革命軍事委員會發言人的身分對新華社記者發表關於皖南事變的談話。他指出：“此次皖南反共事變，醞釀已久。目前的發展，不過是全國性突然事變的開端而已。”“特別是1月17日的命令，包含著嚴重的政治意義。因為發令者敢於公開發此反革命命令，冒天下之大不韙，必已具有全麵破裂和徹底投降的決心。”他說：“目前全國人民的緊急任務，在於以最大的警惕性，注視事變的發展，準備著對付任何黑暗的反動局麵，絕對不能粗心大意。”
毛澤東的這個談話，引起重大反響，不僅“全黨一致擁護，情緒異常興奮”，而且深受黨外人士的好評。國民黨愛國民主人士宋慶齡、何香凝、柳亞子、彭澤民、陳友仁等聯名致信蔣介石，譴責政府當局對新四軍的迫害，要求釋放葉挺；從前怕共產黨過於強硬會引起破裂的民族資產階級代表陳嘉庚、張一鹿等仗義執言；馮玉祥、於右任、孫科等也對蔣介石表示不滿，馮玉祥說：“隻有共產黨的十二條，國事才能解決。”這件事，在國際上也引起廣泛重視。斯特朗、斯諾等在美國報紙上發表報道和評論，向世界披露皖南事變的真相。英、美、蘇等國都不支持蔣介石的作法，對他形成很大壓力。