山本首先改變了老一套的訓練方法。在海軍，艦隊夜間出入港口是艦隊訓練中難度很大且有危險的科目，稍有失誤，就會發生損傷“天皇軍艦”的事故，情節嚴重者要受到切腹的懲罰。因此在已往的訓練中，一般是各艦都要打開信號識別燈，並以無線電保持各艦間的通信聯絡，以免發生軍艦相撞毀傷艦隻的事故，這已成為聯合艦隊不成文的慣例。但山本認為，這是不符合實戰要求的。因為戰時，艦隊出港是不允許打開信號燈和使用無線電的，即使使用微弱的無線電波聯絡也是被禁止的。他要求各艦一律不準開信號燈，並關閉艦上的無線電聯絡裝置。艦與艦間保持一定距離依次跟著各自的旗艦摸黑前進。
這是難度相當大的出入港訓練。幾萬噸的龐然大物，啟動後的慣性是相當大的，在黑暗中各艦保持一定的距離和準確的方向，使艦上人員高度緊張。一旦發現艦與艦間的距離過近時，靠艦上機械的製動能力是很難抑製住巨大的慣性的。山本的目的就是要訓練日本海軍的夜戰能力。
山本五十六在海上進行實戰訓練。接著山本在完成前任總司令官吉田善吾製定的年度訓練計劃後，到1940年便改以他心中構思已久的以航空兵力為中心的訓練1940年3月，山本為了檢驗海軍航空兵的攻擊能力，安排了一次代號為“123號作業”的演習。演習的計劃安排是，駐在誌布的艦隊從有明灣出發，經過九州東岸北上，向佐舊灣進發；航空隊則搜索北上的艦隊並利用夜間對艦隊實施轟炸。
指揮魚雷轟炸機的是“赤城”號航空母艦飛行隊長淵田美津雄少佐。他在發現山本五十六的艦隊之後，便緊緊盯住山本的座艦——旗艦“長門”號。“長門”號打開探照燈，試圖擾亂追蹤飛機的視線，並用高射炮向空中的飛機猛烈射擊，同時，加快艦速拚命躲避。淵田率飛機巧妙地躲開了高射炮的反擊，連連向艦上投放訓練用的魚雷炸彈，彈不虛發，發發命中。
看到這一情景，山本心中十分高興。
如果僅就地位和榮譽而言，山本應當滿足了。因為在日本海軍中，海軍省、軍令部和聯合艦隊是三位一體的。海軍省負責海軍行政，參與內閣決策；軍令部就是總參謀部，負責軍令、作戰計劃和訓練；聯合艦隊司令部是執行機構，是負責指揮作戰的最高機構。作為聯合艦隊的司令長官，也就是一名海軍軍官的最高榮譽了。
可是山本並未陶醉在榮譽和地位的光環裏。
手扶旗艦“長門”號欄杆，望著紀洲海麵上80多艘穿梭往來的軍艦，山本陷入沉思之中。國際局勢日益惡化，日本的對外擴張欲望如脫疆的野馬，海軍中的激進分子正蠢蠢欲動……作為世界第三大艦隊的司令長官，責任重大啊！獻身天皇的責任感和使命感使山本五十六的心情突然顯得格外沉重。
他在給島田繁太郎的信中寫道：“當前，歐洲出現了大動蕩，每當想到我們日本與德、意之間的關係，就使我不寒而栗。”
為了應付可能發生的戰爭局麵，他一麵指揮艦隊日常訓練，一麵針對歐洲戰場局勢的發展，特別是美國海軍的發展和夏威夷太平洋艦隊對日本造成的威脅，把日本海軍防禦線從小笠原群島連結馬裏亞納群島推進到從東卡羅林群島到馬紹爾群島的防線。
令山本五十六最不願看到的事情終於發生。隨著歐洲戰場的急劇變化，荷蘭、法國宣布投降，日本軍部首腦感到無比興奮。他們把眼睛盯上了英法等歐洲國家在東南亞的殖民地，企圖趁其無暇東顧之際，將這些殖民地據為己有，控製太平洋，也從根本上打擊親英美的蔣介石。
發動了侵華戰爭的近衛文在第二次組閣前，召集陸相東條英機、外相鬆岡洋右和海相吉田善吾，在其私邸獲窪山莊舉行了“荻窪會議”，製定了新內閣的行動方針，其中包括建立“大東亞新秩序”，盡快解決中國事變，與德意簽訂三國同盟條約等內容。1940年7月26日，近衛內閣通過了《基本國策綱領》，三國同盟問題再次提上日程。
聞聽此訊，正在海上訓練的山本五十六大為震驚，他多次上書吉田善吾海軍大臣，陳述與德意簽訂同盟條約的危害，指出為避免日美衝突，絕不可締結日德同盟。然而，吉田未能阻止同盟條約的簽訂。盡管山本在海軍首腦會議上極力反對，新任的海軍大臣及川古誌郎強行通過了海軍同意三國同盟條約的決定。三國同盟條約遂於9月27日在柏林簽署，約定三締約國中任何一國遭到尚未參戰的國家的攻擊，三國須用所有政治、經濟和軍事手段相互援助。日本徹底綁上第二次世界大戰的列車。
局勢的變遷終於把山本作為一個悲劇性角色推到曆史的前台。他在內心深處反對同美國交戰，但作為聯合艦隊司令長官的職責又必須麵臨同美國交戰；對英美國家的了解使他深知戰爭必敗，但效忠天皇的武士道精神又迫使他必須奪取戰爭的勝利。