1942年8月，抱著報仇雪恥心理，山本五十六率全部聯合艦隊，再次投入在瓜達爾卡納爾島（以下簡稱瓜島）展開的與美國太平洋艦隊的決戰。
8月8日，由三川中將率領的艦隊首先與美艦隊遭遇，由於美軍的疏忽，三川艦隊在夜裏突然發起的襲擊中大獲全勝。山本意識到美國海軍絕不會善罷甘休，遂率艦隊主力於8月17日南下瓜島，決心與美國決一雄雌。與此同時，負責攻取瓜島的陸軍也派出一本清直大佐率領的1000人先遣隊。比海軍還狂妄的陸軍認為，有1000人就足以解決瓜島問題了。他們不會想到，這時的瓜島已經駐守了擁有各式重武器的美軍精銳部隊1.6萬人。
海軍複仇的心理與陸軍輕敵的思想交織在一起，再一次把日本推向慘敗的深淵。在長達半年的瓜島爭奪戰中，日本共傷亡陸、海、空將士5萬餘人，艦艇24艘（約13萬餘噸位）。1943年2月，山本五十六奉命將瓜島1.3萬名日軍撤回，日本侵略者已是窮途末路了。
山本似乎對日本的命運和自己的命運已經有所預感了。1943年初，他在給好友堀悌吉的信中寫道：“開戰以來，陣亡將士已近1.5萬人，實在令人悲傷、慨歎。痛定思痛，我寫下這兩句詩文，以抒鬱懷：兵戈聲聲一年去，陣亡將士若雲消。”
在給原田雄熊的信中，他甚至寫道：“我已做好在今後百日之內貢獻餘生的思想準備。”山本要以自己的行動證明他曾經說過的“以我眾多部下的性命去換取大量敵人傷亡之時，即是我惡貫滿盈之日”。
1943年2月，山本再次將旗艦移至更加豪華的“武藏”號。在這艘堪稱世界一流的戰列艦上，山本推出“伊號作戰”計劃，準備在南太平洋再次組織大規模的反擊。誰也沒曾想到，山本竟會在這次精心策劃的戰役中丟掉了性命。1943年4月7日，聯合艦隊按計劃發起第一次攻擊，由於日軍戰鬥力的下降和美海軍的有力防禦，日軍沒有達到目的。為了不使山本失望，飛行隊長竟然謊報戰功，使山本誤認為“伊號作戰”旗開得勝。在以後的4天中，空中作戰部隊繼續誇大戰果。為了鼓舞士氣，慰問將士，就在原計劃的最後一天，即4月13號，山本突然決定視察部隊。這一提議當即遭到部下的堅決反對。可是，一意孤行的山本很少聽從別人的勸阻。4月18日，按照事先安排。山本率視察隊伍登上了前往巴萊爾的飛機。此時，準確截獲了山本行動情報的尼米茲上將早已布下了天羅地網。9點34分，在4架P－38“閃電”式戰鬥機的猛烈炮火下，視察人員的座機相繼墜落。
美機圍殲山本五十六。第二天，日軍搜索部隊找到了失事地點。隻見山本坐在飛機的座墊上，左手握軍刀，套有白色手套的右手也按在軍刀上，左胸流著血。山本的軍醫長高田六郎少將倒臥在旁邊，兩具屍體都已生蛆，臭氣衝天。
據後來推測，山本臨死時的情景可能是：飛機墜毀後，高田還沒死，他把山本拖出機艙，經過匆忙的整容後，自己也斷了氣。4月20日，海軍少佐軍醫田淵義三郎寫下下麵的屍檢報告：“左肩腫骨的中央部，有一個食指大小的子彈孔，子彈的走向是右前上方；左下頜角有一個小手指肚大小的子彈射入孔，出口在右眼外眼角，像拇指壓痕一樣大小……顯然係因損傷主要內髒器官而致命。”
1943年5月21日，日本政府發布了山本的死訊，追授他大勳位、功一級、正三位和元帥稱號。6月5日，山本的國葬儀式在東京舉行。儀式之後，骨灰一分為二，一部分安葬在東鄉平八郎的墓旁，一部分由他的姐姐高橋嘉壽子帶回故鄉長岡長興寺。
山本五十六果然如他信中所說，在百日內就結束了自己的生命，但他在太平洋戰爭和珍珠港犯下的罪惡卻使愛好和平的人們至今思之猶痛。