5月28日，由斯普魯恩斯少將指揮的第16特混艦隊離開珍珠港，兩天後，由弗萊徹指揮的第17特混艦隊也向預定海域進發。日本聯合艦隊尚未采取實質性重大行動，美國海軍就已經撒開了一張無形的大網，等待日軍來投了。
對於即將來臨的厄運，山本似乎有所察覺。5月28日出發前，他在給情婦千代子的信中流露出不安：“29日就將起錨出征，在海上約需3周左右的時間，我將親自指揮全軍奮戰。說心裏話，對這次出征作戰，我並不寄予多大希望。今天是紀念日，道路崎嶇坎坷，已到頂點。”（紀念日指日本海軍節）。
山本的話不幸言中，就在山本的潛艇警戒部隊到達預定海域時，美第16、17特混艦隊早就通過了。6月1日和2日，情報部門發現美軍調度頻繁，“大和”號甚至截獲了美國航空母艦在夏威夷的信號。然而，一向嗅覺靈敏的山本對此卻無動於衷，甚至於運輸艦隊已遭到了中途島空軍的兩次襲擊，也未能引起山本的警覺。
6月5日，按時到達中途島西北240海裏水域的南雲艦隊向島內發起攻擊。這時，南雲隻有18架戰鬥機執行空中戰鬥巡邏任務，龐大的艦隊成了美軍隨時獵取的獵物。正如淵田美津雄中佐當時所描述的：“我們就像一個背著滿口袋黃金，單身在森林裏趕路的人，自然會引起強盜的注意。哪個強盜發現了，都會首先猛撲過來。”自信有餘的南雲忠一根本就不相信附近會有美國艦隊。
由於島上早有準備，南雲的第一次攻擊毫無收獲。南雲沒有采納防備敵艦襲擊的建議，決定對中途島發動第二次攻擊。正當4艘航空母艦上的勤務人員匆忙為飛機換裝炸彈時，中途島對南雲艦隊的攻擊開始了。南雲的3架零式戰鬥機迅速投入戰鬥，美國海軍6架攻擊機或墜或逃。南雲忠一輕輕地鬆了一口氣。
恰在這時，日軍4號偵察機由於走錯了航線，意外地發現了美國特混艦隊，並立即發回了消息。突發的敵情變化使得盲目自信又墨守成規的南雲忠一吃驚不小，他拿不定主意是攻擊美國艦隊還是進攻中途島，因為進攻中途島的飛機剛裝上炸彈，南雲的護航飛機已經很少了。
第2航空母艦戰隊司令官敦促南雲，應當立即攻擊美國艦隊，而南雲卻作出了暫時向北挺進，捕捉並殲滅敵機動部隊的指示。這樣，剛剛換上進攻中途島炸彈的飛機不得不再次換裝魚雷和對艦炸彈，這些換下來的普通炸彈被任意擱置，最終導致了巨艦的引爆自毀。
6月5日6時25分，美國艦隊的攻擊開始了。然而，戰鬥力極強的日本零式戰鬥機3個小時內便擊退了美軍不下8次空襲。正當南雲趁空襲間隙下達“第二攻擊波準備起飛”命令時，美俯衝轟炸機群突然向航空母艦撲來。僅僅幾分鍾時間，南雲的多艘艦隻中彈起火，“赤城”、“加賀”、“蒼龍”3艘航空母艦失去了作戰能力，隻剩下“飛龍”號航空母艦在山口多聞司令官的指揮下孤軍奮戰。
下午2點30分，美軍轟炸機發動了新的攻擊，山口無奈地下達了棄艦命令，並把自己綁在艦橋上沉入海底。此時，像賭紅了眼的賭徒一樣的山本五十六已經明白，日本失敗的命運已定。21點15分，他下達了停止攻擊中途島的命令。
中途島之戰，日本海軍元氣大傷，共損失了4艘航空母艦，1艘重巡洋艦，322架飛機，3500多名官兵，而軍事力量明顯處於弱勢的美國海軍，卻隻損失1艘航空母艦，1艘驅逐艦，147架飛機和307名士兵。這一結果明顯改變了太平洋日美軍事力量的對比。山本五十六預謀已久的速戰速決速談判的計劃徹底破產。從此，為了護衛本土和鞏固對南方資源地區的占領，日本軍部取消了原來的作戰計劃，不得不采取保守的防衛措施。相反，擁有雄厚工業基礎的美國的軍事力量卻日益壯大。中途島戰役成了第二次世界大戰的重要轉折點。
中途島戰敗，山本心情沮喪，懊惱萬分。他在給自己親朋及情婦們的信中不時流露出厭倦的心態。然而，被武士道精神和賭徒心理浸透了靈魂的山本五十六決不會就此消沉下去。