格瓦拉向剛果起義軍傳授遊擊戰術，計劃利用坦噶尼喀湖西岸的解放區作為基地，訓練剛果及周邊國家革命武裝。此時他已37歲，且並未受過正規軍事訓練，戰鬥經驗大都來自古巴革命。
此時，與剛果政府軍一道的美國中情局人員，正全程監控格瓦拉部隊的對外通信，以便於在其遊擊隊來襲前能先發製人，截斷其補給線。格瓦拉在此役所期許的，是能向當地辛巴人灌輸古巴共產革命思想及遊擊戰術，將他們訓練成一批驍勇善戰的遊擊隊。
事後格瓦拉在日記裏回憶，當地人組織起來的烏合之眾愚笨、漫無紀律、內部紛爭不休，從而導致了起義失敗。同年，病弱的格瓦拉在非洲叢林吃足了7個月苦頭後，沮喪地與剩存的戰友離開了剛果。他曾一度考慮將受傷士兵送回古巴後，自己留下來戰到最後一刻，用生命為革命豎立典範。不過，經不住同誌們苦苦哀求，他還是與他們一起走了。
但是格瓦拉並沒有回到他熟悉的古巴。在卡斯特羅公布的格瓦拉道告信裏，他宣稱將斷絕一切與古巴的聯係，投身於世界其他角落的革命運動。為此格瓦拉深覺在道義上自己不應回古巴。
接下來的6個月裏，格瓦拉極其低調地遊走於坦桑尼亞首都達累斯薩拉姆、捷克首都布拉格以及東德。他除了記載自己在剛果的經過外，還開始起草兩本書，準備對經濟學及哲學加以論述。
卡斯特羅在獲悉格瓦拉下落後，極力要求他的老同誌回古巴去。後者明確聲明，除非為了在拉美國家進行革命活動，因地利之便，他會在絕對機密的情況下回古巴進行籌備工作外，將不再踏上這片土地。
1966年至1967年間，格瓦拉開始在玻利維亞帶領遊擊隊員進行革命活動，化名拉蒙。當地共產主義者購買了一片密林移交給他用作訓練區域。格瓦拉及其古巴同誌亦編改了一些遊擊隊員軍隊方式。格瓦拉的第50號遊擊隊員有著精良裝備及早期在險峻山區與玻正規兵作戰的經驗。然而在9月，軍隊卻設法想消滅第二個遊擊隊小組，殺害其中一個領導。
玻利維亞總統得知格瓦拉的存在後，揚言要殺死他。他下令軍隊四處搜尋他們。希望挑起革命的格瓦拉對玻形勢的錯誤判斷令他後來慘敗，因為他沒有在意玻身後的美國。
發現了格瓦拉的革命活動地點後，美國政府很快派出CIA人員進入玻利維亞援助反革命，政府軍的裝備和戰鬥力大為加強。而格瓦拉卻得不到地方分離分子及玻共產黨的預期協助。用於與古巴聯絡的兩台短波發射機又已損壞，令他無法寄發消息到哈瓦那。遊擊隊員用於為從哈瓦那發出的短波解碼的錄音機亦在渡河中丟失。這使格瓦拉完全被隔離，他的形勢顯得十分不妙。
CIA還幫助反對卡斯特羅政權的古巴流放分子設立審訊室，拷打那些被認為協助格瓦拉的玻利維亞人。為搜尋格瓦拉的支持者，幾乎有30萬人受到政治迫害。
1967年10月，格瓦拉遊擊隊中的一個逃兵向玻利維亞特種部隊透露了他們的營地。幾天後，格瓦拉正在附近巡邏時，特種部隊包圍了營地並捉住了他，他在腿受傷後被迫投降。他身上的衣服幾乎全部被叢林撕破，一絲一縷的，有如乞丐。
關於格瓦拉被擒和槍決時的情景，有好幾個版本。
有的說，衝突期間，有幾個士兵想接近他，他喊道：“不要射擊！我是切·格瓦拉，我活著對您來說比死更有價值。”
而另一說法是，他被捕獲時身份仍然不為人所知。當時他佩帶著一隻剛收到的禮物勞力士手表。總統知道他被擒後，便馬上命令處死他。
格瓦拉被囚在一個破落的校舍一夜後，第二天下午便在手被綁在板上的情況下，被一個抽簽抽到了短秸稈的玻利維亞陸軍中士槍斃了。
格瓦拉臨死前曾向那名中士說：“我知道你要在這裏殺我。開槍吧！懦夫，你要殺死的，是一個男子漢！”而另一個版本是，劊子手行刑前顫抖著不敢開槍，格瓦拉平靜地對他說：“開槍吧，膽小鬼，你隻是要殺死一個人而已。”他還對他的敵人們說：“革命是不朽的。”
一些人認為，那個中士是向格瓦拉的麵部和喉頭開槍。但廣泛受認同的是，他開槍射擊格瓦拉的雙腿，以令他的麵孔完整便於證明身份；並假裝是作戰的創傷以隱瞞他是被槍斃的。他們咬住格瓦拉的胳膊以免其大聲呼喊，最終見他太痛苦而向其胸口開了槍。
格瓦拉的屍體被直升機送到一個地方醫院並展示給傳媒。那時被拍攝照片成為一個傳奇，很多人頌揚他為聖人。當一名軍醫切斷了他的雙手後，玻利維亞陸軍將校將其屍首轉運去了一個秘密地方，並拒絕透露他的遺骸是否已被埋沒或火化。
另外據說，有人當時曾剪下格瓦拉的一些頭發，並準備以700萬美元高價進行拍賣。
玻利維亞當局10月11日正式向全球報告格瓦拉已於9日被殺。15日卡斯特羅宣告古巴全國哀悼3天。格瓦拉之死被認為大力鼓吹了當時社會主義革命運動思想已遍及拉美和其他第三世界國家。
時隔40年後，2007年，美國中情局前特工、從古巴流亡邁阿密的菲利克斯，首次披露了格瓦拉被處死前的情況（近似上文描述），並稱美國政府當時曾極力反對對格瓦拉執行死刑，希望將他運到巴拿馬做進一步審訊，但這一要求卻遭到了玻利維亞最高軍事當局否決。當他對格瓦拉說對不起時，後者立即說：“這樣更好，我根本就不應該活著被俘虜的。”
格瓦拉犧牲時，他帶領的遊擊隊幾乎全軍覆沒，隻有極個別人幸存。而他的屍體究竟埋在哪裏，事隔多年已沒人能說得清。20世紀90年代，包括玻利維亞在內的南美國家已相繼完成政治民主進程，使尋找格瓦拉和他戰友的遺骨出現轉機。
據玻軍方提供的線索，格瓦拉和另6名遊擊隊員遇難後不久就被埋在距格蘭德峽穀5公裏的一個叫卡尼亞達的地方，此地現為一個廢棄的機場。當時參加掩埋的幾個證人回憶，因為是在夜間進行，周圍黑乎乎的，根本就記不住地點，隻記得他們被埋在同一墓穴裏。
在玻政府支持下，1995年11月底，玻利維亞、阿根廷和古巴聯合組成專家小組，著手調查和尋找掩埋格瓦拉的地方。他們查閱了大量曆史資料，采取世界上最先進的高科技手段，使發掘範圍縮到最小。古巴先後派出10餘名頂級專家協助發掘工作。